菜心bZIP基因家族分析报告
菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee），又名菜薹，是十字花科芸薹属白菜亚种的变种。作为我国华南地区的特产蔬菜之一，其品质柔嫩，营养丰富，深受消费者的喜爱。菜心生长周期短，复种指数高，可周年生产供应，在应对蔬菜生产淡季上具有重要作用。
众所周知，菜心在生长发育过程中极容易受到周围环境变化的影响，其中干旱、盐碱、低温等环境胁迫因子更是制约作物产量、品质的重要因素。干旱因其持续时间长、作用范围广而作为普遍存在于全球范围内的自然灾害，对作物生长发育带来了巨大的影响。
通过对菜心的转录因子进行研究，可以揭示其在环境逆境中的调控机制。例如，针对干旱胁迫，研究人员可以探究菜心中与干旱适应相关的转录因子家族，如DREB（dehydration-responsive element binding protein）家族。DREB转录因子通过结合特定的DNA序列，调控一系列与干旱逆境响应相关的基因表达，从而增强植物对干旱的耐受性。
此外，转录因子的研究还有助于揭示菜心的生长发育调控网络。通过分析特定转录因子的功能和调控机制，可以了解其在不同生长阶段和不同组织中的作用，如花期控制、果实发育和叶片生长等。这些信息对于优化菜心的品质特性具有重要意义。例如，通过调控与营养合成和色素积累相关的转录因子，可以提高菜心中维生素、矿物质和色素等营养物质的含量，改善其口感、风味和外观
bZIP转录因子由一个碱性区域和一个亮氨酸拉链结构组成，其中碱性区域相对保守，约由20个氨基酸残基组成，它能够通过固定的核定位信号结构N-（X) 7-R/K与DNA顺式原件特异性结合。亮氨酸拉链结构域不保守，同时含有大量疏水残基，疏水残基一般位于第3和第4位；亮氨酸拉链结构域的N末端与酸性区域密切相连。在功能上可将bZIP转录因子家族主要划分为4个原始bZIP亚族，不同亚族分别行使不同的功能，包括参与逆境胁迫、种子发育、病菌防御、光信号转导、调控维管发育等作用。其中，A亚族主要参与ABA和逆境胁迫的调控表达，C亚族主要参与种子发育和病菌防御，D亚族参与病害防御和生理生长，G亚族参与光信号调控，H亚族在光合作用过程中起关键作用。
二、物种基因组序列与注释信息获取
菜心（B. rapa）的基因组序列及其注释信息均下载自BRAD数据库 （http://brassicadb.org）。拟南芥（A. thaliana）的bZip基因序列下载自TAIR （http://www.arabidopsis.org/）。
采用TBtools软件提取菜心CDS序列，并翻译成蛋白序列。（Step1. 根据注释文件提取cds文件；step2. 将cds序列转换为蛋白序列；使用Sequence Toolkit中的 ORF Prediction——> Batch Translate CDS to Protein，这一步要注意的是输入和输出文件路径中不能有中文，否则会报错）
通过hmmsearch和BlastP两种方法搜索菜心的全基因组蛋白序列，去冗余后获得374个序列，经Pfam和CDD鉴定结构域，并参照拟南芥bZip家族中4个亚族结构域的特征，去除特征结构域不完整的序列，最终在甘蓝型油菜基因组中鉴定到130个bZip基因。（HMMER主要用在识别同源蛋白或核酸序列，特点是利用了先验数据，在已知保守和高变异区基础上，计算比对分值常见于结合pfam数据库。Blast作为最常用的序列比对工具生物准确性低于HMMER，但速度快。在进行Bzip家族鉴定分析时，通过blast方法得到的结果一共有151，而HMMER为137，但是blast操作更为简便，HMMER的结果可信度更高，HMMER方法更优。）
提取蛋白序列后，提交到NCBI CDD数据库进行结构域可视化（首先打开NCBI的Batch CDD 网页进行在线分析，设置输入Bzip基因家族蛋白序列点击提交，下载结果文件，为txt格式，可以根据需要选择。之后在TBtools中可视化，在设置输入下载的txt文件和P450蛋白序列文件，点击开始），结果如下：
分别从大白菜数据库和拟南芥数据库下载了 bZIP基因序列，利用TBtools提取蛋白序列并构建系统进化树。（准备格式为fasta的文件，打开TBtools选择最上面一栏菜单的Others >Phylogenetics > MUSCLE Wrapper，在文件夹中选择文件，输入保存路径，注意要把最后保存的文件名也写上，最后点击stat alignment开始比对，选择最上面一栏菜单的Others >Phylogenetics >trimAL Wrapper，此步骤是对多序列比对后的结果文件进行修剪，使用的是trimAL软件，选中多序列比对的结果文件，输入保存路径和文件名，最后点击start开始修剪，利用IQ-tree进行建树，基于最大似然法构建系统发育树，选择最上面一栏菜单的Others >Phylogenetics >IQ-tree Wrapper，选中修剪后的结果文件，输入保存路径和文件名前缀，最后点击start开始建树，系统发育树构建成功后，会弹出一个对话框，点击确定，软件会自动生成可视化进化树图，可以保存）
与拟南芥相比，菜心bZIPs转录因子可分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和S共10组，每组bZIP蛋白的数量分别为11、2、4、16、6、5、4、2、9、15。
应用MEME（https：//meme–suite.org/meme/）预测分析bZIP蛋白序列的结构域，搜寻Motif值设置为10，结构域宽度设定为最小10、最大100，其他参数为默认值，在输出结果中点击MAST XML output下载。再利用TBtools对保守结构域进行筛选和可视化保守 Motifs 分析。（TBtools中 Visualize Gene Structure完成, 基因组注释gff文件和bZIP基因名）
在Motif 分析中，除包含bZIP转录因子保守的结构域外，还有其他的保守基序，共测出了包括bZIP结构域（Motif 1和Motif 7）在内的10个基序。bZIP成员不仅具有bZIP相关的功能，也具有其他的潜在功能，被系统进化分析分为同一组的b ZIP成员都预测到了相同的功能。综上所述，除了bZIP结构域区域外，有一些bZIP转录因子通常还含有额外的保守基序，这些基序可能指示潜在的功能位点或参与激活bZIP蛋白的功能。
进化树+保守Motifs+基因结构（含保守结构域）综合可视化（TBtools中 Gene Structure View （Advanced）, 共输入4个文件，从上到下，第一个进化树的.nwk格式文件，第二个MEME结果文件.xml格式，第三个基因组注释文件。gff格式，第四个Batch-CDD结果文件（这个需要手动修改，第一列基因名，第二列，起始位置，第三列终止位置，第四列蛋白质结构域）。）
三 基因分析在食品工业方面的应用
菜心bZIP基因的研究和改良在营养改良、抗逆性改良和品质改良等方面具有潜在应用。通过分析这些基因的功能，我们可以了解其在植物代谢途径中的作用，如维生素、矿物质、抗氧化物质等的合成和调控。基于这些信息，我们可以通过遗传改良或基因编辑等技术手段，调控bZIP基因的表达，进而提高植物中营养物质的含量和品质。例如，通过增加特定bZIP基因的表达水平，可以增加菜心中维生素C的含量，从而提高其营养价值。此外，研究还可揭示bZIP基因在调控植物代谢途径中的交互作用，从而更好地了解植物的代谢网络和调控机制。
菜心bZIP基因的研究还可以应用于抗逆性改良。逆境胁迫对植物生长和产量造成负面影响，如高温、低温、干旱、盐碱等。通过深入研究bZIP基因在逆境响应中的调控机制，我们可以揭示其参与的信号传导途径和调控网络，从而培育出更具抗逆性的菜心品种。通过遗传改良或基因编辑等技术手段，调控bZIP基因的表达或突变，可以增强菜心植物对逆境的耐受能力，提高产量和品质。这种抗逆性改良对于应对气候变化和提高农作物稳定性具有重要意义。
菜心bZIP基因的研究对于品质改良也具有潜在应用。bZIP基因参与了植物生长和发育的调控，包括花期控制、果实发育和成熟等关键过程。通过深入研究菜心bZIP基因的功能和调控机制，我们可以更好地了解这些过程的分子调控网络，为菜心的品质改良提供指导和策略。
通过调控bZIP基因的表达水平或突变，我们可以影响菜心的品质特性，如口感、风味、颜色等。例如，特定的bZIP基因可能参与花青素合成和调控，从而影响菜心叶片的颜色。通过增强或抑制这些基因的表达，我们可以调整叶片的色素积累，改善菜心的外观吸引力和市场竞争力。此外，研究还可以揭示bZIP基因在调控植物发育过程中的交互作用和调控网络，从而帮助我们更好地理解菜心的生长发育，进一步改进其品质特性。
通过深入研究bZIP基因的功能和调控机制，我们可以揭示植物生长发育和代谢调控的关键过程，为菜心的改良和优化提供理论指导和实践基础。这将有助于提高菜心的营养价值、增强其抗逆性能力，并改善其品质特性，为人们提供更健康、高品质的食品选择。然而，进一步的研究和实验验证仍然是必要的，以确保这些潜在应用能够得到有效的应用和推广。