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MET 14号外显子跳跃突变难以识别？阅读本文带你明辨是非

原创市场部绘真医讯 2022-04-26 17:16 发表于江苏

在我们认真阅读基因检测报告时，相信会经常看到错义突变、移码突变、截短突变等耳熟能详的基因变异类型。然而，当初次发现变异类型为MET 14号外显子跳跃突变（MET exon 14 skipping，下称MET 14跳突）的时候，你很可能会感到很新颖，基因还有跳跃突变呢？然后一连串的问题，陷入茫然，跳跃突变是啥啊？可以用靶向药吗...

不要着急，今天咱们就一起揭秘这个听起来生涩的MET 14跳突，如何在众多的MET变异中对它明辨是非？鉴于介绍内容较多，咱们不妨先列个问题提纲再细细道来：

一、什么是MET 14号外显子跳跃突变？
二、MET 14号外显子跳跃突变为什么导致癌症？
三、MET 14跳突的多种变异名称如何解释？
四、MET 14号外显子跳跃突变发生的位置有哪些？
五、如何快速辨认MET 14跳突？
六、MET 14跳突各类型发生比例如何？
七、如何精准全面地检测MET 14号外显子跳突？
八、不同检测平台对MET 14跳突的检测结果有差异吗？
九、MET 14跳突的肺癌患者有哪些靶向药物？

一、什么是MET 14号外显子跳跃突变？

MET 14跳突是由MET基因突变导致的特殊结构变异，咱们了解下DNA的结构，DNA分子是由编码氨基酸的外显子（exon）和非编码氨基酸的内含子（intron）交错组成。DNA在转录翻译成氨基酸时，规则性地将内含子剪去，而各外显子连接成连续的mRNA分子进行氨基酸的翻译（图1a）[1-2]。这个过程中，mRNA正常剪接受识别位点调控，包括外显子和内含子交接的“剪接区域”以及内含子上的多个位点都调控mRNA的正常翻译。一旦这些区域发生突变异常，mRNA的正常剪接会受到影响，导致蛋白翻译差错。所以不难理解，MET 14跳突就是由于MET基因转录调控的关键识别区域发生了异常突变，导致MET转录时mRNA跳过了14号外显子，形成13号外显子和15号外显子直接相连而14号外显子发生丢失的现象（图1b）[2]。

图1.MET 14跳突发生和致病机制图示

显而易见，引起外显子跳跃的因素终归还是基因突变，只不过突变的位置是关键：剪接区域？内含子上？但的确是致癌因素之一，广泛存在于肿瘤患者中。

二、MET 14号外显子跳跃突变为什么导致癌症？

MET基因是常见的原癌基因，突变、扩增等激活突变均能导致癌症，而这14号外显子跳跃突变如何致癌呢？这就要从MET 14号外显子的功能说起。
事实上，MET 基因第1003位置的酪氨酸（Y1003）残基的区域能与E3泛素连接酶CBL的结合，行使MET蛋白降解功能，保障细胞正常增殖（图1c，2A）。而MET 14跳突外显子丢失就会使MET蛋白无法与CBL结合，这样MET蛋白持续激活下游信号通路，促进肿瘤细胞快速增殖和发展（图1d，2B）[2-3]。事实上，不仅MET 14跳突，只要涉及Y1003区域的突变都会导致MET蛋白降解减少。但这些外显子深处的突变并不能导致MET 14跳突。所以总结下，MET 14号外显子和周围内含子中的多个变异区域都可能导致MET功能异常而激活肿瘤信号通路，变成肿瘤的“帮凶”，而由于RNA剪接异常造成“MET 14号外显子跳跃突变”较为常见。

图2. MET 14号外显子跳跃突变信号调控机制

那么问题来了，是不是只要是MET基因14号外显子及其周围的突变都属于MET 14跳突？命名上有什么特别之处？先别激动，咱们要介绍辨别信息和方法了。

三、MET 14跳突的多种变异名称如何解释？

首先，了解下基因变异的命名规则-HGVS（human genome variation society）[4]，相信这也是各基因检测报告变异命名的参考标准。对于报告中常见的“c.”和“p.”，两者是对同一变异在DNA序列和氨基酸序列的分别命名，实为对应关系。“c.” 描述编码DNA（coding DNA）序列的变异，“p.”描述蛋白质（protein）氨基酸序列的变异；以参考序列的首位碱基/氨基酸进行计算，变异中的数字则是对应的具体位置，如c.3028G>A即表示MET基因编码序列的3028位核苷酸由原先的G突变成A，对应的蛋白层面变化则是p.Asp1010Asn，表示氨基酸序列第1010位天冬酰胺取代了原先的天冬氨酸（图3）。而对于c.2888-16_2888-1del和c.3028+3A>G则是外显子上游（-）和下游（+）的内含子区域内的变异，内含子为非编码氨基酸区域，所以偶然见到这种有+和－的DNA变异描述，无须困惑，内含子突变嘛，没有氨基酸变化是正常的。

图3以MET基因举例内含子和外显子变异命名

四、MET 14号外显子跳跃突变发生的位置有哪些？

我们先知晓在14号外显子周围的4个功能区域（剪接供体区域、剪接受体区域、分支位点、多聚嘧啶区域），因为MET基因变异只要影响到这4个功能区域就会导致MET 14跳突（图4）[5-6]。还要明确14号外显子上第一个和最后一个碱基位点命名（c.2888和c.3028），因为几乎所有的MET 14跳突的命名都是以这两个位点（数字）为基准（MET转录本号：NM_000245）。例如内含子中的突变：c.2888-16_2888-1del和c.3028+3A>G。当然，MET 14跳突的变异命名也因参考的基因转录本不同而异，当你发现c.2942和c.3082为基准的命名时，大概率MET转录本号是NM_001127500.3，若确认属实后，依然适用判读[7]。

图4. MET 14跳突功能区域和真实位点检出（综合[6]和[8]研究作图）

看得出，这4个功能区位置上大体分为两类：一类是位于14号外显子首末两端经典剪接区域：剪接供体区域和剪接受体区域；另一类是位于13号内含子较深处的的分支位点和多聚嘧啶位点。结合图4展开来说[5-9]：1）剪接供体区域（splice donor, SD）：SD位于exon14与intron14交接的剪接区域（c.3028或c.3082前后）；剪接供体区域碱基发生突变（c.3028，c.3028+1，c.3028+2，c.3028+3等）,或者覆盖该区域的变异（c.3026_c.3028+7del，c.3028_c.3028+3del等）都能导致MET 14跳突发生。其中，外显子内部的c.3027,c.3028对应的氨基酸为p.X1009和p.D1010，看到这种氨基酸的变异可直接判定MET 14跳突。

2）剪接受体区域（splice acceptor, SA）：SA位于exon14与intron13交接的剪接区域（c.2888或c.2942前后）；剪接受体区域碱基发生突变（c.2888-1，c.2888-2、c.2888等），或者覆盖该区域的变异（c.2888-5_2911del，c.2888-14_2888-5del，c.2888-18_2888-6del）等都能导致MET 14跳突发生。其中，c.2888位于MET 14号外显子区域，对应的氨基酸为p.X963。

3）分支位点（Branch Site，BS）：BS位于13号内含子内部，为14号外显子上游29bp的A碱基位点（c.2888-29），若该位点发生突变或者被其他片段变异所覆盖（c.2888-35_ 2888-17del），可能导致MET 14跳突。

4） 多聚嘧啶位点（Poly-pyrimidine tract，PPT）：PPT同样位于13号内含子内部，为14号外显子上游9bp至24bp的区域（c.2888-24_2888-9），若MET基因小片段缺失片段覆盖或涉及PPT区域（c.2888-28_2888-14del，c.2888-27_2888-12del），可能导致MET 14跳突。

除此之外，位于14号外显子内部的多个错义突变也能致癌，多为MET第1002、1003、1004位氨基酸，但它们并不导致MET 14跳突。所以除了MET 14号外显子跳跃突变外，也有必要进一步确认是否为外显子上激活突变。

五、如何快速辨认MET 14跳突？

重点来了，对于报告中即将看到的MET基因突变？先别激动，捋一下MET 14跳突辨认步骤。

为更贴合实际情况，列举几份报告涉及了不同类型的MET 14跳突供参考：

图5. 绘真医学MET 跳突检出报告示例

如何快速辨认MET 14跳突？

一看内含子/外显子号，排除13和14之外的变异：

intron 表示内含子，exon为外显子，通常MET变异位于13号内含子（intron 13）/14号外显子（exon 14）/14号内含子（intron 14）上才会导致MET 14跳突，其它内含子/外显子无需考虑！

二看位点变异，“数字”是否涉及功能区位点：

这里务必记住两个关键词：c.2888和c.3028（参考转录本：NM_000245）。这是位于c.2888和c.3028位点及周围的变异的标志物。这里只需看变异是不是剪接受体位点SA：c.2888，c.2889，c.2888-1/-2/-3，剪接供体位点SD：c.3028，c.3027，c.3028+1/+2/+3，多聚嘧啶位点PPT：c.2888-24_c.2888-9、分支位点BS：c.2888-29。当你看到c.2942和c.3082时，先确认转录本，若是NM_001127500.3，可替代c.2888和c.3028的作用，也有用这个转录本的报道[7]。

还有很多MET 14跳突都是小片段的缺失/缺失插入（del/indel），以“_”为标志，这些变异区间若覆盖或涉及上述功能位点，也会导致MET 14跳突，例如c.2888-35_ 2888-17del（涉及BS和PPT）、c. 2888-27_2901del（PPT和SA）、c.2888-10_ 2909delinsTCA（SA）或c.3028_ 3028+3del（SD）、c.3028+1_3028+9del（SD）、c.3028_3028+17delinsC（SD）。

三看非14跳突变异，14外显子内部致病变异

前面三步是判定MET 14跳突步骤，其它14号外显子内部的1002、1003、1004位氨基酸激活变异通常表述为p.Y1003X、p. R1004X和p.D1002X（X代表不同氨基酸）。再确认这些位点突变来判定非MET 14跳突类型。

六、MET 14跳突各类型发生比例如何？

既往研究表明[7.10]，MET 14跳突在中国NSCLC患者中的总体比例为1%-2.62%，发生率因病理亚型而异，在腺癌中约为1.0%-2.6%，鳞癌中约为1.5%-4.8%，而在肉瘤样癌中则达到10.5%-31.8%。

一项大型临床研究在60244晚期NSCLC患者中检出了1592例MET 14跳突的患者[11]，携带了共1599种MET 14跳突不同类型，其中组织和血液的检出率分别为2.4%（1458/60244）和1.8%(134/8975)。不同功能区域的MET 14跳突的突变数量和类型均有差别（图7）：5'端剪接供体区域SD(31%)、D1010(22%)、多聚嘧啶序列PT(17%)、5 '端多位点变异(13%)、3 '端多位点变异（12%)、3'端剪接受体SA(2.3%)、Y1003位点（2.3%）和整个外显子缺失（0.44%)。进一步分析发现，在经典剪接3'SA和5'SD位点上，突变类型主要是碱基替换（94%和75%)，而14号外显子的PT区域、5多位点和3多位点的突变方式以indel为主。

图6. 不同区域MET 14跳突在组织和血液样本检出情况[11]

因此，MET 14跳突类型多样并且功能区域覆盖广泛，多数变异位于测序难度较大的内含子区域，血液检测可能存在一定的漏检率，精准检出MET 14跳突似乎是一项挑战。

七、如何精准全面地检测MET 14号外显子跳突？

目前，MET 14跳突的检测方法包括NGS、RT-PCR和Sanger测序，NGS因检测变异类型多、覆盖范围广是NCCN和CSCO指南推荐的检测方法。NGS检测进一步分为DNA水平的测序和RNA水平的测序。2020年哥伦比亚医学中心一项研究用NGS-DNA在644例肺腺癌患者检测到16例（2.5%）MET 14跳突的患者，而当再使用NGS-RNA检测，结果在DNA检测为阴性的样本中另外检出了9例携带 MET 14跳突的样本。究其原因，发现DNA水平测序未覆盖13号内含子剪切受体位点，导致遗漏部分阳性变异[12]。有研究分析了DNA和RNA检测MET 14跳突结果，发现RNA层面的NGS检测MET 14跳突的检出率为4.2%（17/404），显著高于DNA层面的检出率1.3%（11/856）[13]。在两种方法同时检测的286例样本中，RNA检出10例阳性，其中6例在DNA中并未检出。主要是扩增探针设计范围有限或难以满足高质量测序，无法捕获关键突变位点。表明DNA层面检测MET 14跳突时，需全面考虑是否覆盖所有可能发生区域和类型，测序探针的合理设计尤为重要。

图7. NGS-DNA和NGS-RNA检测MET 14跳突的区别[12]

由于MET跳突多发生于DNA内含子区域，而内含子区域涵盖大量的重复或高GC序列导致NGS-DNA测序不佳。基于RNA水平的NGS检测MET 14跳突可能比DNA水平更加全面，但RNA检测需要严苛的组织保存和提取条件，易降解性也是限制NGS-RNA检测的痛点。所以，NGS-DNA和NGS-RNA检测MET 14跳突各具优劣势，最佳方式采取优势互补的双组学检测相信能全面、精准地检出MET 14跳突。

八、不同检测平台对MET 14跳突的检测结果有差异吗？

MET 14跳突挑战不仅存在于不同测序技术之间，其实不同的NGS平台在MET 14跳突检测时也会出现不同的检测结果，我们尤其需要关注的是假阳性。2021年权威杂志《Journal of Thoracic Oncology 》就发表一篇研究报道[14]。

研究采用Oncomine DxTT（FDA批准的NGS肺癌伴随诊断产品，Ion Torrent平台），在50例样本中检出26例为MET 14跳突阳性，24例为阴性。后续又使用了Archer MET（日本获批的MET抑制剂Tepotinib的伴随诊断试剂盒，Illumina MiSeq平台[15]）和RNA层面的RT-PCR技术对这50例样本进行验证，确认出Oncomine DxTT的结果中有8例样本为假阳性，而Archer MET和RT-PCR所有检测结果是一致的。分析发现这8例样本中有3例为测序深度太少导致假阳性，5例是由于14号外显子剪接供体区域存在的重复碱基TTTT导致Ion Torrent测序的假阳性（4个T测成3个T）（图9），由于Ion Torrent平台测序这段重复碱基时少识别一个T，表现为剪接供体移码突变，误认为是MET 14跳突“阳性”。这也是目前Ion Torrent平台测序检测序列准确性的技术瓶颈[16]。

图8. 三种平台检测MET 14跳突结果及Oncomine DxTT检出差异性原因[14]

目前，临床上对MET14跳突的检测报道多集中于假阴性结果，而该研究证明了假阳性也客观存在。我们发现，存在多种影响MET 14跳突测序的不确定因素，包括基因层面的，技术层面的等等，这也是MET 14跳突检测在不同平台或样本间存在广泛差异性的原因。不同的检测平台和技术各具优势，相信随着技术的完善，会有更多的准确性高，覆盖面全的MET 14跳突技术和产品被挖掘。

九、MET 14跳突的肺癌患者有哪些靶向药物？

现阶段，克唑替尼、Capmatinib、Tepotinib、赛沃替尼等多种MET抑制剂已经在MET 14跳突的NSCLC患者中取得了良好的抗肿瘤效果[17]。近两年，Capmatinib和Tepotinib陆续获得FDA批准上市，而赛沃替尼也于2021年被NMPA批准上市，中国MET 14跳突患者迎来了首款获批的MET抑制剂。目前，MET 14跳突检测已被纳入国内外各大指南的推荐用以指导靶向治疗。最新NCCN非小细胞肺癌临床实践指南（2022.v3版）推荐转移性NSCLC患者检测MET 14跳突，阳性患者一线治疗可选择Capmatinib、Tepotinib或克唑替尼（特殊情况下）。

图9. 2022 v3版NCCN指南推荐MET 14跳突患者一线治疗

CSCO指南对于MET 14跳突阳性NSCLC患者的一线治疗，III级推荐Capmatinib、Tepotinib；对于未经靶向治疗的后线患者，II级推荐赛沃替尼，III级推荐Capmatinib、Tepotinib的治疗。

图10. CSCO指南推荐MET 14跳突患者一线及后线治疗

除此之外，《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南2021版》已明确将MET 14跳突与EGFR、ALK、ROS1同等列为NSCLC患者的必检基因[18]。随着MET抑制剂的陆续获批，不仅是MET 14跳突，包括MET扩增都已然成为NSCLC的靶向治疗领域的研究热点，为更好地了解临床前沿进展，在此为您找来MET抑制剂在MET变异的NSCLC患者中的最新临床研究[19]。

图11. 不同MET抑制剂在MET突变患者中的临床研究[19]

精准治疗，检测先行！在推行肿瘤靶向治疗的今天，全面准确的基因检测结果是患者能否获益于靶向治疗的先决条件，期待会有更多新兴的MET基因检测平台和方法被开发，实现MET基因突变的肿瘤患者更多地获益于分子检测和药物治疗。

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