《宏基因组技术及其在微生物学研究中的应用》
学 院： 食品与生物工程学院
小组成员：颜传永 22020080057 材料收集
尹立来 22020080059 材料收集
余文韬 22020080060 文本编写
鄢楚洋 22020080056 文本编写
二○二三年 六 月
宏基因组技术及其在微生物学研究中的应用
摘 要：宏基因组学是以某一特定环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过提取DNA、构建文库、文库筛选等基本流程来研究微生物多样性、进化关系以及寻找新基因等为研究目的的新的微生物学研究方法。其总流程包括环境样品总DNA提取、宏基因组文库构建、宏基因组文库筛选三个阶段。宏基因组学作为一个崭新的技术在微生物酶的领域也取得了一定的进展。本文将就宏基因组学的概念、技术流程和应用三个方面做简单介绍。
关键字：宏基因组学；文库构建；文库筛选；宏基因组学应用；微生物酶
引 言
微生物在自然环境中的分布及其广泛，但是研究发现只有1%的微生物可以通过纯培养方法来获得。事实上微生物是通过群体来执行功能的，对微生物个体的认识不足以全面认识微生物的重要作用。免培养的组学技术实现了从分子水平（DNA、RNA、蛋白质和代谢产物）对环境微生物及其功能进行检测与分析，为研究者了解完整的环境微生物全貌提供了有效的途径。为了了解完整的微生物总基因组信息，Handelsman等于1998年首先提出了宏基因组(metagenome)的概念，指的是土壤微生物的全部基因组的集合[1]，或称环境基因组[2]。环境存在大量未知或不可培养的微生物，宏基因组学由于直接研究环境中的总DNA，为开发新的生物活性物质、发现新的基因和物种、研究微生物群落结构与功能、微生物对环境变化的响应与反馈、微生物群落演替与进化、微生物区域分布与生物地理学、土壤肥力形成与变化机理以及恢复生态学等开辟了一条新的途径，为解释和解决一些重大农业和环境问题提供重要依据。发展至今，宏基因组学是指对环境中直接获得的总DNA进行分析的所有研究[3]。随着微生物宏基因组学技术的应用，该技术也确定了许多重要的微生物功能酶。通过对土壤、动物、水体和极端环境等不同来源的环境样本分析[4]，发现了一些具有潜在应用价值的淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶等几种与生物代谢相关的重要微生物酶。
1 宏基因组学概念
宏基因组是指生态环境中全部微生物基因的总和，这里包括可培养的和不可培养的微生物的基因的总和[5]。宏基因组学研究不需要对环境微生物进行分离培养，而是直接分析环境中微生物的DNA来获知微生物群落的遗传、功能与生态特性[6]。
1.1 广义宏基因组学
广义宏基因组是指特定生态环境下所有生物遗传物质的总和，广义宏基因组学则是以该生态环境中全部生物DNA作为研究对象，应用宏基因组学则是以该生态环境中全部生物DNA作为研究对象，应用宏基因组学方法研究其彼此之间的相互关系[7]。
1.2 狭义宏基因组学
狭义宏基因组学则以特定生态环境下全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，应用宏基因组学方法研究其彼此之间的相互关系[8]。
2 宏基因组学的基本流程
宏基因组学的研究包括两个方面：
①宏基因组文库的构建：这其中包括对环境样品进行处理、提取样品总
DNA、载体链接以及在宿主细胞中进行克隆转化等。
②宏基因组文库的筛选：这其中包括对建立起来的克隆进行筛选，得到我们所需要的克隆。根据其研究目的通常可分为功能筛选和序列筛选两种。
总的来说宏基因组学的基本技术流程为：样品基因组的富集、特定环境中的总基因组DNA的提取、宏基因组温文库的构建、宏基因组文库的筛选、目的克隆的检测[9]。
2.1 样品基因组的富集
在某个特定环境的宏基因组文库中我们所需要的目的基因其实只占很小一部分，因此对环境样品的预富集就显得尤为重要。目前预富集技术主要包括细胞水平富集和基因组水平富集两个层面。基因组水平富集主要是指在目的基因上插入信号，例如用同位素进行标记，最后将这些具有有信号的基因组进行处理进而达到预富集的目的。
2.2 特定环境中的总基因组DNA的提取
特定环境中的总基因组DNA的提取是宏基因组文库构建的关键和难点。目前提取宏基因组DNA的方法主要包括两类：一类是直接提取法，又称为原位提取法；一类是间接提取法，又称为异位提取法[10]。
原位提取法是指直接在环境样品中加入DNA提取缓冲液，然后从样品中提取基因组总DNA。该提取的DNA产量较高，操作容易，成本低，但提取的DNA纯度低，往往还需要进一步纯化才能进行后续操作，并且此法提取的DNA片段长度较短，适合于构建小片段插入文库。异位提取法是指先把需要的微生物细胞分离开来，然后再从这些微生物细胞中提取基因组DNA。该法得到的DNA纯度较高，DNA片段长度相对较长，适合构建质粒文库和细菌人工染色体文库，但此法所得DNA产量不高且所提DNA包含的基因组信息不全面。
2.3宏基因组文库的构建
宏基因组文库的构建是指通过合适的载体系统将带有的宏基因组DNA信息转化到合适的宿主系统，使那些不可培养微生物的DNA再宿主微生物中得以复制、表达[11]。这些转入宏基因组DNA信息的模式微生物克隆就构成宏基因组文库。
载体系统选择再宏基因组文库的构建中具有重要的地位。常用的克隆载体有：质粒载体、BAC载体、噬菌体类载体等。载体系统的选择可根据DNA提取质量、插入片段大小、质粒拷贝数多少、选择的宿主菌及后续筛选方法而定[12]。
宿主系统的选择要考虑转化效率高低、转入的载体能否在宿主细胞中的稳定存在、载体连接的DNA能否在宿主内正确转录表达以及宿主系统是否具有用于后续筛选的缺陷型特征等因素[13]。在众多的宿主系统中大肠杆菌是最为常用的宿主系统。
2.4 宏基因组文库的筛选
宏基因组文库的筛选是指通过一定的技术手段从众多克隆中筛选出我们所需要的克隆或寻找新的基因。依据筛选路径的不同可以分为两大类：依赖序列分析的筛选和依赖功能分析的筛选[14]。
3 利用宏基因组学开发微生物酶
优化利用遗传资源的一项策略是探索自然资源。酶是从自然界探索发现的化合物之一，可以在工业领域中加以利用。这些用于生物催化剂的功能酶对细胞的生物化学过程至关重要，并且在当今的现代工业应用中也是如此。
3.1 宏基因组学在微生物酶上的应用
在制药业中，酶可以用于优化抗生素；一些酶还可用于法医鉴定和临床测试。其中，通过元基因组学从自然界中进行功能酶的探索也逐渐引起人们的关注。1985年，Pace和他的同事对环境样本进行了直接克隆。Nacke等人首次进行了功能导向的筛选，他们研究了纤维素酶的编码基因。随后Rondon等人使用BAC载体和土壤样本建立了稳定的宏基因组文库并发现了核酸酶、脂肪酶和淀粉酶等多种类型的微生物酶[15]。此外，氧化还原酶、酰基酶、水解酶和磷酸酶等也不断得以开发利用。
3.2 宏基因组学在微生物活性物质筛选上的应用
传统的培养方法限制了生物活性物质的开发和利用,宏基因组学技术的发展,使人们能够进行非培养微生物进行活性物质筛选,加快了生物活性物质开发和利用的步伐[16]。研究发现的抗生素的生物合成基因都是成簇排列的,因此有可能克隆到完整的次级代谢产物合成基因簇,使其在异源宿主中表达。
3.3 宏基因组学在筛选新的微生物功能基因上的应用
宏基因组文库构建的主要目的是从环境中筛选到我们所需要的功能基因,目前,利用宏基因组技术已发现的新的功能基因主要有生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因[17]。通过筛选宏基因组文库的基因,寻找相应的微生物功能菌,可以达到认识功能菌效用和发挥其作用的目的。
4 用宏基因组方法开发新酶面临的挑战
一方面，用宏基因组学技术来发现新型酶的难题之一是环境微生物样生态位的选择。微生物生态位在新型生物酶的鉴定和表征中起着重要作用，关键的微生态位是由环境与特定微生物的相互作用驱动的 [14]。Mhuantong 等人对甘蔗渣样品中纤维素分解菌中的酶化合物进行了表征，其数量超过纤维素分解菌。此外，极端环境条件下，如高温和寒冷，在探索其宏基因组的时候，需要更多的准确性，注意预防和谨慎。另一方面，从环境样品中提取DNA也是一大问题，具有挑战性和复杂性。Nie 等人在油性微生物的世界中发现了编码碳氢化合物降解酶的基因。然而，从油性环境微生物中分离出这种生物催化剂是不易的。同时提取于微生物样品的 DNA 常常受到环境中相关腐植酸、碳水化合物和蛋白质等污染物的影响。
5 总结与展望
宏基因组学是对微生物进行基因组学研究的一种新方法，主要分为两种：功能宏基因组学和结构宏基因组学。宏基因组技术在生物资源研究方面有很明显的优势，但是由于该技术还不够成熟，仍然有一些问题需要解决，如：如何高效提取DNA、如何选择更高效的提取载体以及筛选的方法。因为宏基因组学涉及领域十分广泛，我们可以将现代分子技术、计算机技术以及生物信息学与宏基因组技术相融合，在各个领域获得更广泛的应用[18]。目前，多组学技术的联合应用已经成为认识环境微生物群落及其功能的重要手段，而通过组学技术的应用，研究者逐渐意识到生活在土壤、淡水、海水、空气，甚至人体等环境中的微生物，其系统发育的多样性和功能的复杂度远远超过以往的认识[19]。目前，如何利用正处于蓬勃发展时期的大数据分析技术与手段来克服宏基因组学数据解析这一难关，并将分析结果用更易理解与操作的形式展现出来，这是从事环境微生物学、生物信息和统计学研究人员共同的挑战。
同时，宏基因组学技术用于新酶开发的主要挑战是微生物环境生态位和 DNA 提取的复杂。关于这些挑战，可以通过生物信息学、智能筛选、测序技术和合成生物学的综合利用在不久的将来对生物酶提供更好的开发，同时各领域的研究人员增加合作和协调交流，为微生物天然产物酶的发现提供更好的发展条件。
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