猕猴桃 bHLH 转录因子家族的鉴定及生物信息学分析-526互联

猕猴桃 bHLH 转录因子家族的鉴定及生物信息学分析

参与人员：毛甲绪22020080029；陶蓉22020080040；郑慧敏22020080071；沈智峰22020080032

背景

在植物中，第一个被发现的 bHLH 超基因家族成员是玉米 R 基因，实验证明其在花青素合成中起到关键作用（Ludwig et al.1989）。随后，越来越多的 bHLH 被证明参与到了更广泛的生理途径中，其中包括调节光信号（Roig-Villanova et al.2007,Leivar et al.2008）；激素信号转导（Lee et al.2006）；响应机械损伤、干旱、高盐、氧化胁迫（Babitha et al.2015）低温胁迫（Jin et al.2016,Feng et al.2012）、缺铁反应（Huang and Dai 2015,Zhao et al.2016）；共生铵运输（Kaiser et al.1998）和类黄酮类物质合成（Matus et al.2010）。

越来越多的证据表明，植物在应答逆境胁迫过程中，Ca2⁺ 信使、ROS 、MAPK 级联以及 WRKY 和 bZIP 等多种转录因子组成的信号网络起到了至关重要的作用。因此剖析这些信号网络和阐明机制对于了解植物防御反应具有非常重要的作用，但是目前对该方面的认识还存在一定的欠缺，需要更进一步的深入研究。

bHLH 转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，仅次于 MYB 转录因子，在植物应答逆境过程中起到了至关重要的作用。植物在单独或者同时应答多种生物和非生物胁迫时，多个基因在转录水平上发生转录重排并引发下游某些防御反应对于植物应答生物胁迫和非生物胁迫非常重要。bHLH基因在病原菌侵染过程中同样起作用。

已报道的在植物中的 bHLH 家族全基因组鉴定中，拟南芥有161个bHLH家族成员，水稻166个，番茄159个，还有许多非模式植物，如马尾松、苹果、桃子等也相继被报道，猕猴桃（Actinidia chinensis）作为我国本土的一种重要经济果实，其Vc含量丰富，是当之无愧的水果之王，其 bHLH 家族全基因组尚未被揭示。

1 实验方法

1.1猕猴桃 bHLH 转录因子家族鉴定

在猕猴桃基因组数据库（http://kiwifruitgenome.org/）下载所需文件。在 Pfam 数据库（http://pfam-legacy.xfam.org/）中以 bHLH 结构域（PF00010）的隐马尔可夫模型（HMM）作为查询对象，使用 TBtools 软件在猕猴桃蛋白组中进行搜索，提交到 NCBI 上的保守结构域数据库 CDD （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）进行搜索鉴定。并使用 ExPASy网站（https://web.expasy.org/protparam/）分析理化参数（分子量、等电点、氨基酸组成成分、原子组成等）。

1.2 猕猴桃 bHLH 家族蛋白基序(motif)分析

用 MEME 在线工具（http://web.mit.edu/meme_v4.11.4/share/doc/meme.html）识别保守基序，参数设置为：保守基序个数为3，重复次数为零次或一次，其他为默认值。

1.3 猕猴桃 bHLH 家族染色体位置和基因重复分析

用 TBtools 软件根据基因结构注释文件进行基因在染色体上的定位分析，并根据结果对基因重复情况进行分析。

1.4 猕猴桃 bHLH 家族系统进化分析

用 MEGA 5.0 中的邻距法（NJ， Neighborjoining）构建系统发育树，其中校验参数 Bootstrap=1 000。利用 MEGA 5.0 构建 AcbHLH 基因的个体系统发育树和来自 2 个物种（AtbHLH 和AcbHLH）的 bHLH 基因的综合系统发育树，并对猕猴桃 bHLH 基因家族进行分类。

2 结果与分析

2.1 转录因子家族成员鉴定

利用是否含有保守结构域 bHLH 基序（ PF00010），初步获得 214 个 bHLH 候选基因，cdd-search 和 hummer 网站对结构域进行预测分析后，最后得到 159 个猕猴桃 bHLH基因家族成员，将这 159 个成员命名为AcbHLH 001~159，提交 ExPASy 网站对蛋白序列理化性质进行分析后汇总如表一。

表 1 猕猴桃中鉴定出的 AcbHLH 基因家族成员及其基本特性

Table 1 The AcbHLH gene family members in Actinidia chinensis and their basic characteristics

基因ID	原始ID	氨基酸/aa	分子量/Da	等电点/PI	不稳定指数	脂肪系数	总平均亲水指数GRAVY
AcbHLH001	Ach00g239761.2	387	42884.90	5.34	53.41	66.82	-0.628
AcbHLH002	Ach00g129161.2	320	35316.73	6.11	53.10	75.59	-0.630
AcbHLH003	Ach24g233831	255	28680.91	9.20	49.85	89.73	-0.491
AcbHLH004	Ach14g401621.2	426	47589.50	6.28	44.77	78.43	-0.491
AcbHLH005	Ach00g090241.2	278	30867.99	8.43	62.63	73.99	-0.516
AcbHLH006	Ach21g348771	287	31714.80	5.62	58.77	86.76	-0.396
AcbHLH007	Ach00g067431.2	263	28449.77	7.77	57.06	66.50	-0.651
AcbHLH008	Ach26g084581.2	317	34968.10	8.17	48.93	89.62	-0.248
AcbHLH009	Ach03g030051.2	296	31766.79	5.28	54.09	84.39	-0.253
AcbHLH010	Ach23g359571	493	54752.64	6.22	40.76	79.43	-0.437
AcbHLH011	Ach00g477371.2	160	17644.99	5.93	45.47	98.69	-0.280
AcbHLH012	Ach04g049191.2	316	34724.77	5.93	53.23	75.98	-0.460
AcbHLH013	Ach08g030801.2	282	31604.17	4.73	56.53	64.26	-0.544
AcbHLH014	Ach04g087151.2	278	30961.07	5.58	61.69	81.83	-0.430
AcbHLH015	Ach05g207091.2	393	43871.80	9.13	50.20	72.93	-0.610
AcbHLH016	Ach08g104421.2	593	66119.54	6.64	51.44	76.12	-0.498
AcbHLH017	Ach26g271161.2	233	26176.35	6.76	49.16	60.69	-0.775
AcbHLH018	Ach00g367441	254	28462.27	8.20	69.34	87.20	-0.407
AcbHLH019	Ach08g181261	176	19726.56	9.10	29.53	80.91	-0.535
AcbHLH020	Ach21g211521.2	818	88828.88	5.80	46.31	77.35	-0.339
AcbHLH021	Ach26g217751.2	272	30571.42	5.77	56.98	81.73	-0.683
AcbHLH022	Ach25g373971.2	211	23947.59	7.06	41.76	55.45	-0.904
AcbHLH023	Ach00g271541	246	28116.79	5.55	63.48	78.54	-0.527
AcbHLH024	Ach05g432931.2	343	38662.48	5.30	53.15	79.27	-0.590
AcbHLH025	Ach01g235091.2	380	40558.85	5.35	41.76	59.68	-0.306
AcbHLH026	Ach00g374511	189	21297.56	11.08	73.12	79.10	-0.749
AcbHLH027	Ach16g465301.2	282	30960.37	5.93	63.27	67.09	-0.723
AcbHLH028	Ach17g464411.2	446	49396.71	5.04	69.58	75.90	-0.715
AcbHLH029	Ach18g071731.2	572	65039.95	5.39	48.01	80.77	-0.451
AcbHLH030	Ach10g189921.2	627	68336.32	5.26	48.26	70.43	-0.527
AcbHLH031	Ach00g445451.2	220	24088.61	8.70	50.39	63.00	-0.391
AcbHLH032	Ach08g253811.2	356	39694.10	5.18	63.74	84.63	-0.475
AcbHLH033	Ach00g021041.2	289	31874.25	5.41	65.78	65.88	-0.616
AcbHLH034	Ach24g054201	293	31425.43	5.29	56.39	83.24	-0.278
AcbHLH035	Ach06g232701.2	391	43461.47	5.33	55.38	65.88	-0.653
AcbHLH036	Ach20g368981	243	27658.45	5.08	60.30	88.31	-0.459
AcbHLH037	Ach00g104991.2	254	27878.35	8.08	46.83	69.17	-0.569
AcbHLH038	Ach11g336631.2	248	27436.25	4.82	69.10	64.48	-0.714
AcbHLH039	Ach14g313661.2	434	48072.20	6.37	48.96	82.88	-0.421
AcbHLH040	Ach00g061231.2	478	53789.14	8.35	59.56	78.58	-0.494
AcbHLH041	Ach08g104681.2	517	57585.97	5.62	40.56	77.83	-0.451
AcbHLH042	Ach26g253521.2	237	26486.70	8.48	48.36	67.09	-0.719
AcbHLH043	Ach00g281761	251	28311.25	8.69	47.73	79.96	-0.456
AcbHLH044	Ach00g346471.2	212	23541.38	8.83	41.88	65.75	-0.692
AcbHLH045	Ach13g458711.2	330	37101.37	6.90	58.46	77.36	-0.338
AcbHLH046	Ach01g088391	352	38449.41	5.49	56.22	86.96	-0.388
AcbHLH047	Ach21g394631.2	291	31663.39	5.43	57.02	74.50	-0.488
AcbHLH048	Ach04g361801.2	336	37646.47	5.56	55.33	55.51	-0.838
AcbHLH049	Ach00g105191	292	32481.17	5.24	57.96	70.45	-0.661
AcbHLH050	Ach00g480881.2	254	28480.35	8.73	62.74	83.74	-0.409
AcbHLH051	Ach18g092921.2	152	17726.97	8.83	72.61	71.78	-0.998
AcbHLH052	Ach07g463871.2	603	66643.75	6.16	39.80	75.85	-0.496
AcbHLH053	Ach07g157501	274	30982.42	6.32	60.57	78.54	-0.325
AcbHLH054	Ach02g293201	246	27610.86	6.00	64.35	83.21	-0.761
AcbHLH055	Ach13g309021.2	294	33001.02	5.11	47.18	77.99	-0.563
AcbHLH056	Ach05g147821.2	350	39542.57	6.10	52.49	79.06	-0.560
AcbHLH057	Ach04g249371.2	348	37821.13	6.10	57.86	60.55	-0.727
AcbHLH058	Ach25g177941.2	500	55699.43	8.81	38.20	76.24	-0.455
AcbHLH059	Ach23g359461	296	31436.58	5.91	41.23	75.24	-0.282
AcbHLH060	Ach00g033091	94	10671.23	10.27	86.88	71.70	-0.971
AcbHLH061	Ach26g405101.2	275	30683.46	8.82	44.79	88.95	-0.249
AcbHLH062	Ach01g326561.2	473	53421.63	6.14	60.96	80.78	-0.485
AcbHLH063	Ach02g292881.2	104	12186.45	7.92	87.31	45.87	-1.227
AcbHLH064	Ach15g111891.2	307	34254.41	8.48	58.56	61.27	-0.623
AcbHLH065	Ach09g064141.2	351	38384.03	5.80	51.22	74.44	-0.544
AcbHLH066	Ach23g267831.2	638	70072.59	7.03	46.65	72.13	-0.547
AcbHLH067	Ach23g176631.2	217	23653.60	5.36	57.35	77.83	-0.512
AcbHLH068	Ach26g322811.2	528	57418.55	7.26	58.00	60.21	-0.769
AcbHLH069	Ach16g017431.2	204	22995.80	8.27	43.53	67.30	-1.021
AcbHLH070	Ach06g283551.2	187	19988.14	7.85	44.99	54.81	-0.862
AcbHLH071	Ach24g233841.2	94	10981.24	5.16	55.20	77.87	-0.838
AcbHLH072	Ach00g076641.2	714	76883.87	6.46	57.93	62.02	-0.619
AcbHLH073	Ach21g299091.2	371	40447.98	5.70	60.60	63.88	-0.689
AcbHLH074	Ach28g123541.2	483	53917.84	6.53	59.45	57.54	-0.743
AcbHLH075	Ach07g340591.2	346	38269.15	6.47	61.52	64.28	-0.787
AcbHLH076	Ach16g157701	405	41615.28	6.19	57.06	70.96	-0.421
AcbHLH077	Ach00g011091.2	417	44133.79	6.63	41.55	56.98	-0.411
AcbHLH078	Ach17g439741.2	259	27602.08	5.77	50.28	78.07	-0.366
AcbHLH079	Ach28g212861	316	35426.92	5.07	42.09	79.87	-0.457
AcbHLH080	Ach05g159561.2	325	36173.64	6.43	42.94	71.14	-0.820
AcbHLH081	Ach20g091661	234	27437.32	8.62	54.43	72.95	-0.751
AcbHLH082	Ach08g009641	471	52234.29	5.50	48.95	76.56	-0.563
AcbHLH083	Ach00g397521.2	221	24462.87	4.90	65.18	62.67	-0.631
AcbHLH084	Ach00g032761	274	31029.92	5.31	60.49	77.96	-0.492
AcbHLH085	Ach01g308091.2	409	43140.98	4.99	43.45	76.63	-0.389
AcbHLH086	Ach01g353411.2	177	19419.67	8.28	47.28	65.71	-0.688
AcbHLH087	Ach08g302211.2	653	73706.34	5.13	46.75	79.59	-0.484
AcbHLH088	Ach09g174051.2	368	40970.70	5.21	51.31	67.80	-0.690
AcbHLH089	Ach13g017831	493	54782.50	6.08	44.44	74.48	-0.515
AcbHLH090	Ach06g169871.2	228	25904.91	9.42	54.49	66.18	-0.756
AcbHLH091	Ach08g096211.2	289	30734.91	9.44	50.03	66.61	-0.527
AcbHLH092	Ach00g329831.2	255	28924.10	5.05	55.93	68.78	-0.828
AcbHLH093	Ach26g241401.2	464	51670.07	6.32	52.73	55.67	-0.766
AcbHLH094	Ach04g159461.2	238	25753.16	8.43	52.10	59.87	-0.437
AcbHLH095	Ach16g021861.2	180	20821.86	9.36	25.77	77.39	-0.533
AcbHLH096	Ach06g053731.2	442	49734.56	8.85	37.92	81.15	-0.564
AcbHLH097	Ach27g338981.2	343	38342.77	5.41	56.90	74.69	-0.699
AcbHLH098	Ach24g313111.2	343	37685.20	9.51	47.89	82.48	-0.296
AcbHLH099	Ach19g137551.2	181	20425.69	9.54	28.42	97.29	-0.307
AcbHLH100	Ach04g087871.2	291	33170.33	4.65	58.17	76.36	-0.613
AcbHLH101	Ach21g417621.2	93	9879.13	8.58	41.02	77.74	-0.530
AcbHLH102	Ach05g192881.2	265	29211.08	6.11	54.72	58.15	-0.813
AcbHLH103	Ach26g217961	272	29566.77	6.02	62.53	69.93	-0.678
AcbHLH104	Ach18g244201.2	593	66655.91	5.51	52.34	80.52	-0.522
AcbHLH105	Ach25g177891.2	635	69871.98	5.46	46.98	73.24	-0.421
AcbHLH106	Ach00g480871.2	254	28494.38	8.73	63.26	84.13	-0.411
AcbHLH107	Ach13g389001.2	551	60163.57	5.89	67.52	59.38	-0.520
AcbHLH108	Ach26g084621.2	653	71853.26	5.54	48.35	69.48	-0.602
AcbHLH109	Ach25g430521.2	573	65494.56	8.84	52.82	83.80	-0.632
AcbHLH110	Ach26g078531.2	536	58810.51	5.91	64.16	58.71	-0.602
AcbHLH111	Ach00g310341	428	47228.11	5.30	45.19	83.53	-0.362
AcbHLH112	Ach17g177021.2	696	76829.77	6.09	66.60	52.83	-0.679
AcbHLH113	Ach06g332351.2	292	31991.40	5.06	59.09	61.47	-0.671
AcbHLH114	Ach08g056701.2	332	37372.19	6.08	58.12	78.40	-0.561
AcbHLH115	Ach15g403241.2	297	33677.26	6.76	50.23	85.93	-0.472
AcbHLH116	Ach00g247731.2	383	42386.46	7.66	53.74	75.35	-0.680
AcbHLH117	Ach03g244361.2	262	28956.03	5.12	61.04	71.83	-0.601
AcbHLH118	Ach07g440891.2	326	36137.87	8.58	39.69	78.37	-0.490
AcbHLH119	Ach00g128751.2	332	36465.86	9.28	59.29	62.05	-0.665
AcbHLH120	Ach19g138241.2	286	30590.62	5.26	63.36	57.41	-0.385
AcbHLH121	Ach13g329601.2	403	41374.18	6.20	55.55	73.97	-0.350
AcbHLH122	Ach14g178981.2	333	37129.48	6.20	61.77	58.59	-0.941
AcbHLH123	Ach01g136071.2	597	66249.55	6.64	46.30	75.95	-0.481
AcbHLH124	Ach00g309341	241	26411.38	5.53	66.49	65.15	-0.651
AcbHLH125	Ach25g096511	289	31994.51	7.72	51.88	83.46	-0.284
AcbHLH126	Ach15g105951	466	51880.98	5.57	46.05	76.97	-0.556
AcbHLH127	Ach00g146261.2	350	38320.93	6.49	58.01	63.80	-0.606
AcbHLH128	Ach03g007901.2	402	44480.70	5.98	50.89	64.53	-0.694
AcbHLH129	Ach12g069961.2	338	37029.25	6.17	63.72	60.30	-0.662
AcbHLH130	Ach04g396431.2	244	26368.22	9.70	47.82	70.04	-0.382
AcbHLH131	Ach01g466331.2	241	27263.54	9.12	78.04	93.44	-0.322
AcbHLH132	Ach23g121441.2	400	43631.85	6.34	65.93	53.45	-0.628
AcbHLH133	Ach28g321841	337	37283.36	7.69	62.86	87.95	-0.373
AcbHLH134	Ach28g395541.2	287	30484.54	6.32	48.16	86.76	-0.252
AcbHLH135	Ach06g441691.2	544	59199.40	5.43	53.11	65.92	-0.531
AcbHLH136	Ach04g440091.2	316	34724.77	5.93	53.23	75.98	-0.460
AcbHLH137	Ach01g088091.2	255	28265.15	6.60	46.80	55.45	-0.852
AcbHLH138	Ach24g313181	636	69859.08	6.05	42.79	73.21	-0.526
AcbHLH139	Ach27g338911.2	314	35878.95	5.37	55.09	79.75	-0.462
AcbHLH140	Ach00g361761.2	235	26702.26	5.65	62.85	89.87	-0.447
AcbHLH141	Ach07g346301	429	47453.59	6.47	48.60	82.03	-0.393
AcbHLH142	Ach23g335591.2	239	26994.68	5.13	36.33	84.90	-0.385
AcbHLH143	Ach07g000591.2	218	25109.24	6.56	53.63	63.12	-0.976
AcbHLH144	Ach25g096541.2	654	71900.36	5.76	48.33	70.24	-0.580
AcbHLH145	Ach14g317751.2	242	27680.14	8.60	66.18	79.34	-0.793
AcbHLH146	Ach19g357141	326	36585.53	5.71	55.05	57.73	-0.658
AcbHLH147	Ach06g448391.2	94	10688.21	10.27	82.21	71.70	-0.999
AcbHLH148	Ach01g394971.2	292	33373.63	4.83	71.53	85.51	-0.550
AcbHLH149	Ach12g075131	227	26499.49	9.58	50.84	73.52	-0.657
AcbHLH150	Ach15g243731	491	54844.09	7.17	44.97	78.98	-0.482
AcbHLH151	Ach29g355681.2	319	35367.49	5.94	54.49	70.88	-0.774
AcbHLH152	Ach06g332761.2	253	27439.77	6.70	48.79	67.15	-0.538
AcbHLH153	Ach23g333271.2	230	25355.97	8.45	50.96	77.65	-0.573
AcbHLH154	Ach03g354401.2	276	30968.35	8.50	43.82	96.67	-0.385
AcbHLH155	Ach05g147751	133	15321.80	10.52	47.52	81.35	-0.803
AcbHLH156	Ach13g144791.2	339	37377.24	5.44	41.41	81.89	-0.410
AcbHLH157	Ach10g270131.2	161	18199.25	5.85	37.49	107.14	-0.086
AcbHLH158	Ach09g174141.2	423	45923.70	4.92	51.55	73.76	-0.615
AcbHLH159	Ach09g013141.2	334	36626.82	5.41	65.00	70.45	-0.610

从结果上看，编码氨基酸数从 93（AcbHLH101）～818（AcbHLH020），平均长度为 342 个氨基酸。通过 Ex-pasy预测其分子量大小为 9.88 kD（AcbHLH101）～88.83 kD（AcbHLH020），等电点为 4.65（AcbHLH100）～11.08（AcbHLH026）。从以上理化性质来看，虽然 bHLH TFs 的保守结构域中存在碱性区域，但酸性氨基酸富集于蛋白质分子中，因此 67.30% 猕猴桃 bHLH 家族蛋白等电点小于 7，大部分呈弱酸性，此现象与拟南芥及水稻相同。猕猴桃中 bHLH 家族蛋白质总平均亲水指数在 −1.227（AcbHLH063）～ −0.086（AcbHLH157）之间，均为负值，说明该家族蛋白均属于亲水性蛋白。不稳定指数介于25.77（AcbHLH095）～87.31（AcbHLH063），其中仅有9个属于稳定蛋白（II<40），剩余 94.34% 均为不稳定蛋白（II>40）。脂肪指数介于45.87（AcbHLH063）~ 107.14（AcbHLH157）。

2.2 蛋白保守基序(motif)分析

猕猴桃 159 个bHLH 基因保守基序分析结果如图 1，2 所示。

图 1 猕猴桃 bHLH 结构域 WebLogo图

Fig 1. The WebLogo plot of Actinidia chinensis bHLH domain

注: 不同位点上氨基酸字母的高度代表保守性的高低; 保守性高于 50% 的氨基酸用大写字母表示

猕猴桃 bHLH 保守基序进行分析结果如图 3 所示，每一个亚家族之间的转录因子尽管它们的长度差别很大，但是它们的保守基序长度及位置都很相似。motif1-10 在图中用不同的颜色表示，10 个保守基序的详细信息表旁标注所示。除 bHLH 保守结构域外，bHLH 转录因子家族还含有其他保守型的结构域，但 Motif1和 Motif2 总是相邻，两者共同构成了 bHLH 结构域。这些保守元件是转录因子发挥其调控作用所必需的，对于维持蛋白质的三维构象和与靶基因的结合至关重要。

图 2 猕猴桃 bHLH 转录因子的保守基序分析

Fig 2. The conserved motifs analysis of Actinidia chinensis bHLH transcription factors

2.3 染色体位置和基因重复分析

159 个猕猴桃 bHLH 基因家族成员在染色体上分布如图4所示。AcbHLH001～AcbHLH159 在 29 条染色体中呈不均匀分布，其中 Chr00 号染色体上分布最多为 29 条，29 号染色体最少为 1 条。一般认为，基因之间的距离小于 100 kb 的即为串联复制，分析发现，猕猴桃染色体上存在基因串联复制现象的有 Chr1 上的AcbHLH004 和 AcbHLH005；Chr4 上的 AcbHLH016、AcbHLH017和AcbHLH018，AcbHLH019 和 CsbHLH020；Chr05上的 AcbHLH024、AcbHLH025、AcbHLH026和AcbHLH027；Chr06 上的 AcbHLH033 和 AcbHLH034，AcbHLH035 和 AcbHLH036；Chr07 上的 AcbHLH040和AcbHLH041；Chr08 上的AcbHLH051和 AcbHLH052； Chr09 上的 AcbHLH054 和AcbHLH055；Chr 18上的AcbHLH083和AcbHLH084；Chr21上的AcbHLH093和AcbHLH094；Chr23上的AcbHLH100、AcbHLH101和AcbHLH102；Chr24上的AcbHLH104和AcbHLH105，AcbHLH106和AcbHLH107；Chr25上的AcbHLH109和AcbHLH110，AcbHLH112和AcbHLH113；Chr26上的AcbHLH117和AcbHLH118，AcbHLH120和AcbHLH121；Chr27上的AcbHLH124和AcbHLH125；Chr00上的AcbHLH136和AcbHLH137，AcbHLH142和AcbHLH143，AcbHLH158和AcbHLH159。

图 3 猕猴桃 bHLH 基因在染色体上的定位

Fig. 3. Chromosomal locations of Actinidia chinensis bHLH gene family

2.4 系统进化分析

为了研究猕猴桃 bHLH 基因家族的进化关系，利用鉴定出的 159 条甜橙 bHLH 蛋白序列与 161条拟南芥 bHLH 蛋白序列构建进化树（图 4）。根据拟南芥中 bHLH TFs 的分类系统和甜橙 bHLHTFs 进化树的分类情况，全部成员分为 16 个亚族，其中第 V 亚族中的 bHLH 成员数量最多，共 38 个，第 II、V亚族中的成员数量最少，仅为 1 个。其中第VI和第XI为两个，猕猴桃与拟南芥在第I、II、III、VI、XIII共四个亚家族中的成员数量差距较大，且前者的数量均小于后者的50％，而在其他亚家族中二者的数量差别不大，以上结果表明猕猴桃 bHLH 家族基因历史演变的过程中发生了基因扩增或收缩。

图 4 猕猴桃和拟南芥 bHLH 基因家族的进化树

Fig. 4. Phylogenetic tree based on Actinidia chinensis and arabidopsis bHLH transcription factors

3结论与讨论

bHLH 家族在真核生物转录因子家族中是一个大家族，并在生物的生长发育、生理及新陈代谢过程中发挥着一系列的重要调节作用。已经在诸如苹果（Malus domestica）、樱桃（Cerasus pseudocerasus）、短柄草和拟南芥等植物中鉴定了 bHLH 家族的转录因子，并对其生长与生物和非生物胁迫之间的关系也做了研究。耿晶晶的研究报道鉴定出 56 个甜橙 bHLH 家族成员，并分析了其在低温胁迫下的表达模式[35]。在本研究中，利用生物信息学的手段对甜橙中的bHLH TFs 进行鉴定，并对其理化性质、保守结构域、系统进化关系、染色体上的位置分布及在不同组织中的表达情况等方面进行了分析，为bHLH 基因家族在基因表达调控、结构和功能等研究提供参考，为揭示 bHLH 家族基因参与植物生长发育机制的调控提供参考。

通过分析验证从猕猴桃中鉴出了 159 个 bHLH基因（表 1），根据基因在染色体上的位置，将猕猴桃 159个 bHLH 基因分别命名为 AcbHLH001～AcbHLH159，bHLH 保守结构域是由 HLH 区和碱性氨基酸区和两部分组成。研究者发现，在番茄bHLH 转录因子家族中同样存在高度保守的 Glu9、His5、Arg13 及 Arg10 等氨基酸残基，在 HLH 区也存在高度保守的氨基酸残基 Leu23 和 Leu64。HLH 区的保守氨基酸残基与二聚体形成相关，而碱性氨基酸区保守氨基酸残基与靶基因的结合紧密相关。

染色体定位分析发现，基因在染色体上的分布不均匀，基因复制是基因重组以及扩增的最主要途径，其主要包括串联重复和大片段复制 2 种方式。串联复制的序列与保守区域非常的相似，进化树中的它们的亲缘关系也很近，因此推测，在进化的过程中他们的功能也类似，但还有待进一步的研究验证。通过在线软件 MEME 对猕猴桃159 条 bHLH 基因的保守基序进行分析，从中找到了 10 个高度保守氨基酸基序，保守基序分析显示，同一亚家族中的大多数保守基序相似，表明每个亚家族中编码蛋白的功能是稳定的，Motif1和 Motif2 几乎存在于所有的 AcbHLH 蛋白中，且总是相邻，共同构成 bHLH 结构域，综上，所有这些 bHLH 保守基序在同一亚家族的独特性及保守性也是对甜橙 bHLH 基因家族的进化分类的佐证，同时推测，除 bHLH 结构域外的其他保守基序也是每个亚家族发挥其相应功能的关键。

为了研究猕猴桃 bHLH 基因家族的进化关系，本研究把 159 个 bHLH 划分为 16 个亚族，同一亚家族内的成员大都具有相同的保守基序。bHLH TFs 家族成员数量巨大，对其进行分类有一定难度。bHLH TFs 参与植物多种调控代谢活动。

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