易基因：NAR：ChIP-seq等揭示蛋白质酰基化与c-di-GMP协同调控放线菌发育与抗生素合成机制

易基因细菌ChIP-seq测序分析结果见刊《Nucleic Acids Research》

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2023年06月07日，华东理工大学生物工程学院和生物反应器工程国家重点实验室叶邦策教授和尤迪副教授为共同通讯作者、博士生符瑜为第一作者以“A meet-up of acetyl phosphate and c-di-GMP modulates BldD activity for development and antibiotic production”【1】为题在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）杂志发表研究论文。该研究以放线菌（Actinobacteria）为研究对象，揭示了蛋白质酰基化与c-di-GMP协同调控放线菌发育与抗生素合成机制的研究新进展。深圳市易基因科技有限公司为本研究提供ChIP-seq测序分析服务。

标题：A meet-up of acetyl phosphate and c-di-GMP modulates BldD activity for development and antibiotic production（乙酰磷酸和c-di-GMP协同调控BldD活性，促进抗生素开发和生产）

时间：2023-06-07

期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：IF 19.16

技术平台：EMSA 、ChIP-seq、Western blot、RT-PCR、质谱、免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）等

摘要：

放线菌（Actinobacteria）是一种普遍存在的细菌，会同时经历复杂的生长发育和抗生素生产以响应应激或营养胁迫。放线菌的这种生长发育主要受c-di-GMP和广域调控因子BldD互作调控。迄今为止，调控这些细胞生物学过程的上游和整体信号网络仍然未知。在红霉素生产菌（红霉糖多孢菌，Saccharopolyspora erythraea，S. erythraea）中，研究结果表明外界环境氮胁迫引起积累的乙酰磷酸（acetyl phosphate，AcP）与c-di-GMP协同调控BldD活性。AcP诱导的K11位点乙酰化显著抑制BldD形成二聚体并与靶DNA解离，干扰c-di-GMP的信号通路，从而调控发育变化和抗生素生产。此外，BldDK11R的实际突变可绕过乙酰化调控，强化BldD对红霉素合成的正调控能力，提升红霉素终产量。AcP依赖性乙酰化的研究通常局限于酶活性调控。本研究结果揭示了AcP诱导的乙酰化共价修饰与c-di-GMP非共价结合协同调控放线菌发育与次级代谢的分子机制，开拓了翻译后修饰的新功能，有助于全面理解微生物固有的翻译后修饰系统对整体代谢网络（营养代谢与合成代谢）的交互作用及其调控规律，显示了基于酰基化修饰调控的原理和分子机制在合成生物系统工程化设计方面的应用潜能。AcP与c-di-GMP信号整合在一起，调节BldD发育和抗生素生产活性，以响应环境胁迫。这种连贯的监管网络可能在放线菌中广泛存在，因此具有广泛意义。

图形摘要

研究背景：

蛋白质的翻译后修饰是一种所有生命体固有的调控机制，对于调控细胞功能，决定细胞生长、发育等生命活动有序、高效进行具有重要作用。放线菌作为产抗生素种类最多、最具商用价值的微生物细胞工厂，其次级代谢产物广泛应用于医、农、畜牧业及医药研究等各个领域。放线菌次级代谢产物的产量和种类与形态分化密切相关，该过程受到营养信号与代谢波动的级联网络调控。已有的研究表明，放线菌的形态分化主要由第二信使c-di-GMP和广域调控因子BldD的互作控制，但影响该过程的上游信号及其作用机理仍然未知。解析其分子机制并精准调控放线菌的形态分化，对于全面理解放线菌生理代谢的分子基础，及以放线菌为底盘的高效合成生物系统工程化设计理论与方法研究具有重要意义。【2】

研究结果：

（1）AcP诱导的BldD乙酰化强烈影响其DNA结合活性及与c-di-GMP互作

图1：AcP诱导的BldD乙酰化强烈影响其DNA结合活性及与c-di-GMP互作

（2）BldD主要通过K11乙酰化失活

表1：不同条件下的BldD乙酰化位点

图2：BldD主要通过K11乙酰化失活

（3）K11乙酰化抑制BldD与其靶基因结合的整体结果

图3：S.erythraea中BldD靶基因ChIP-seq分析。

peaks中心区域和TSS区域的ChIP-seq信号密度热图（±5 kb）。
S.erythraea ObldDK11Q（红色）和ObldD菌株（蓝色）的ChIP-seq信号。
BldD靶向启动子的ChIP-seq数据。ObldD（蓝色）、ObldDK11Q（红色）。绘图跨~2 kb的DNA序列。

（4）K11乙酰化促进生长发育并抑制抗生素生产

图4：K11乙酰化促进BldD介导的发育并抑制抗生素生产

（5）氮胁迫使细胞内AcP浓度升高，从而增加了BldD的K11位点乙酰化水平

图5：氮胁迫增加了BldD的K11位点乙酰化

（6）AcP诱导的乙酰化和c-di-GMP诱导的多聚化协作在放线菌中保守

图6：放线菌中BldD蛋白的系统发育树

关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。

DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。

应用方向：

ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位