1，首先需要得到待克隆的基因的CDS序列，上游UTR约250bp，下游UTR约250bp。将上游250bp和CDS序列和下游250bp拼起来，ctrl+C复制。
2，打开Primer Premier 5软件（自行激活），选择DNA Sequence。
3，把序列粘贴到空白面板处，弹出的框框直接点OK。
4，再点Primer。
5，在弹出的框框中点search。
6，弹出这么一个框框，因为用上下游各250bp的UTR作为正/反向引物设计，所以正向引物Sense Primer的位置是1到250。我的这个基因两个UTR和CDS加起来的整体的长度是1935bp，所以反向引物的位置是在1685到1935。最后一个是PCR产物的大小，我的CDS长度是1353，所以就是1353到1953。
7，点OK，OK。又弹出这么一个框框。一般对前5个结果进行挑选。
8，以第二个结果为例，点一下之后，回到这个框框中，点左边的S，代表Sense正向，再点Edit Primers。
9，弹出这么的框框，可以看长度，Tm值和GC含量，底下还能看引物是否有发夹结构，引物二聚体，错配。可以在那个小框里自行调整序列，比如我喜欢长一点的，我调整到19~25bp，前后都可以根据自己的序列进行加减微调碱基，再点右边的Analysis信息就会更新。三个只红了一个错配，还行。那我就挑选这个序列作为正向引物了，选中复制粘贴就行。
10，接下来就是回到第8步，点A，代表Anti反向。一样的操作。一对引物的Tm值和长度要相近。复制粘贴这段序列就行，它会自行从5’端开始的。一定要把信息记录好，将序列信息发给公司合成引物就行了。
11，公司送到引物后，就可以做PCR，一般是连T载，转大肠杆菌，然后涂板挑点摇菌，菌落PCR出来单条带就可以送样测序了。因为公司测序前后50bp都是不准的，且单端测序只能测约800bp，这种方法可以确认基因的全长，尤其是基因的两端，往后就可以设计含同源臂的引物再连接各种载体了。引物设计还可以用NCBI网站，具体教程百度即可。
12，再次感谢我漂亮的吴师姐~
#未来日记~