NAC-EXPANSIN模块通过控制珠心消除来提高玉米籽粒大小

接下来，我们通过将过表达系列OE1（作为母本）与四个不同的精英纯合系列进行杂交，评估了ZmEXPB15在分子育种中的潜在应用。所有四个携带转基因阳性植株的F1杂种具有显著更高的HKW，与对照的非转基因杂种相比（Fig. 2s, t）。HKW的增加范围为2.8%到12.4%，平均为6.3%。籽粒长度和宽度也增加了，尽管不同的杂种在哪个大小性状上发生改变不同（Supplementary Fig. 6a, b）。此外，大多数杂种不影响其他性状，如穗长（Supplementary Fig. 6c–e）。与我们的发现一致，ZmEXPB15通过母源作用来调控籽粒重量，大多数使用OE1作为雄本的互换杂交杂种的HKW没有显著变化（Supplementary Fig. 6f）。因此，ZmEXPB15显示出在增加籽粒重量方面具有潜在的应用价值。

ZmEXPB15在发育中的籽粒的胚核组织中特异表达

ZmEXPB15在调控籽粒性状中的母源作用表明，在早期籽粒发育期间，它可能在母源组织中表达和发挥功能，这一观点得到了公开可用RNA-seq数据中其在胚核组织中高表达的支持（Supplementary Fig. 7）20。我们的实时定量反转录PCR（qRT-PCR）分析进一步证实了这一表达特点，显示ZmEXPB15仅在2-8 DAP的早期发育阶段表达，其中4 DAP时表达水平最高，而这个时候胚核组织富集（Fig. 3a）。为了更仔细地研究其表达模式，我们使用针对ZmEXPB15的反义探针进行了2到12 DAP的RNA原位杂交，当母源的胚核组织仍然存在。我们观察到在胚核组织中有特异的表达模式，从2 DAP开始，并在8 DAP后逐渐减少，当胚乳开始迅速膨胀时（Fig. 3b）。我们还生成了一个携带ZmEXPB15与绿色荧光蛋白（GFP）融合的转基因系列，其在其天然启动子下进行检测其亚细胞定位。我们在胚核组织中观察到了强烈的GFP信号（Fig. 3c），这个信号在8 DAP时逐渐减弱，与原位杂交所显示的其动态转录分布一致。在质壁松解后，GFP信号在细胞壁、胞质和细胞核中清晰可见（Fig. 3d）。我们的研究结果表明，ZmEXPB15在胚核组织中特异表达，解释了它在籽粒发育中的母源作用。

ZmEXPB15促进胚核组织细胞扩张和消失

为了探究ZmEXPB15如何影响胚核组织的发育，我们比较了两个NILs的胚核组织大小，发现在具有更高ZmEXPB15表达的大籽粒线HKW9Mc中的胚核组织比HKW9V671厚（Fig. 4a）。HKW9Mc中的胚核细胞的细胞面积、细胞长度和宽度显著大于HKW9V671中的细胞，而细胞数量相当（Fig. 4b–g；Supplementary Fig. 8a）。这些观察结果表明，ZmEXPB15可以促进胚核组织的细胞扩张，导致较大的胚核组织体积。在早期籽粒发育期间，胚核组织经历一种被认为是程序性细胞死亡（PCD）的退化过程，伴随着胚乳组织的扩张21。这两个对抗性的过程协调进行22。为了探究ZmEXPB15如何协调胚核组织的发育，测量了从0到12 DAP的两个NILs的胚核组织面积。在0 DAP时，两个NILs的胚核组织面积比相同，都是100%，然而，从3 DAP开始，两个NILs之间的胚核组织面积与胚核组织的比例不同，大籽粒HKWMc中的比例显著低于小籽粒HKWV671中的比例（Fig. 4h，i）。在12 DAP时，HKW9Mc中的胚核组织与胚核组织面积比约为25%，而HKWV671中的比例约为50%，这表明HKW9Mc中存在更快的胚核组织扩张和胚核组织消除，而HKW9Mc具有更高的ZmEXPB15表达水平（Fig. 4i）。一致的是，在ZmEXPB15敲除（KO1）系列中观察到了ZmEXPB15对协调胚核组织和胚乳组织发育过程的相同影响，其中胚核组织与胚乳组织面积的比率高于对照组，而在过表达（OE1）系列中则相反（Supplementary Fig. 8b）。这些结果表明，ZmEXPB15参与了胚核组织的消失，从而协调了胚乳组织的发育。

为了确认上述的猜测，我们进行了末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记末端（TUNEL）实验，以监测ZmEXPB15如何调控胚核组织的消失过程。在高度表达ZmEXPB15的大籽粒线HKW9Mc中，我们在早期的2 DAP就检测到了TUNEL阳性的细胞核，并在后来的阶段增加。相反，在小籽粒线HKW9V671中，TUNEL信号在3 DAP几乎不可检测到（Fig. 4j），尽管在两个NILs之间的6 DAP时，TUNEL阳性细胞核的分布变得不可区分（Fig. 4j）。此外，ZmEXPB15敲除（KO1）系列显示TUNEL阳性细胞核的出现明显延迟，而ZmEXPB15过表达（OE1）系列与对照组相比则相反（Supplementary Fig. 8c, d）。这些结果表明，ZmEXPB15可以促进胚核组织的细胞程序性死亡（PCD）过程。此外，作为细胞死亡的另一个更具代表性的标记物，Evans蓝染色显示，在4和6 DAP阶段，大籽粒线HKW9Mc中的胚核细胞染色明显更深，而小籽粒线HKW9V671中的胚核细胞染色较浅（Supplementary Fig. 8e）。一致的是，ZmEXPB15过表达系列（OE1）从早期的2 DAP开始染色也更深（Supplementary Fig. 8f）。这些观察结果揭示了ZmEXPB15促进了胚核组织的PDC过程和细胞死亡，以确保及时的胚乳组织发育，这可能是增加籽粒大小和重量的原因。

种子发育中的PDC涉及多种类别的蛋白酶，包括半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶23。我们接下来比较了两个NILs之间一些已注释的蛋白酶基因的表达，包括与大麦VPE4同源的液泡处理酶4（VPE4），已知在大麦壳层中执行程序性细胞死亡24,25、与拟南芥木质丝氨酸蛋白酶1（XCP1）同源的半胱氨酸蛋白酶5（CCP5），在木质部形成期间促进导管元素的分解26、与拟南芥衰老相关基因SAG15同源的丝氨酸蛋白酶1（SER1），在老化叶绿体中进行蛋白质降解27、与拟南芥天冬氨酸蛋白酶1（AED1）同源的天冬氨酸蛋白酶1（AED1），可能降解胞外蛋白质28。所有这些潜在与PDC相关的基因在HKW9V671的4 DAP籽粒中的表达水平均明显较低，与HKW9Mc相比（Fig. 4k）。这个结果与在HKW9V671中ZmEXPB15表达水平较低的情况下PDC延迟的观察结果一致。综上所述，我们提出ZmEXPB15通过促进胚核组织的PDC并协调胚核组织和胚乳组织之间的对抗性发育，积极调控早期籽粒发育。

ZmNAC11和ZmNAC29可能激活ZmEXPB15的表达

我们的关联分析和ZmEXPB15表达水平与籽粒重量的相关性使我们推测，特定的顺式元件可能调节了ZmEXPB15在两个NILs之间的表达差异。因此，我们调查了ZmEXPB15的启动子区域，发现了几个CACG基序，这些基序是NAC转录因子（TFs）的已知结合位点29,30。位于ATG上游的-286 bp和-283 bp处的两个SNP位点位于一个CACG基序中，这也与HKW相关联（Fig. 1k）。为了寻找潜在的与ZmEXPB15启动子结合的NAC TFs，我们查看了来自8-DAP玉米籽粒的胚乳转录组数据31，并发现ZmNAC11和ZmNAC29，两个密切的同源基因，在胚乳中高度表达（Supplementary Fig. 9）。我们的qRT-PCR和mRNA原位杂交分析确认，这两个NAC TFs主要表达在胚乳中，并在4-DAP籽粒中达到峰值，与ZmEXPB15的表达模式相似（Fig. 5b, c）。

为了研究ZmNAC11和ZmNAC29蛋白对ZmEXPB15启动子的DNA结合，我们使用了一个含有ZmEXPB15启动子中CACG基序的探针，该探针含有两个NILs中的两个SNP位点（Fig. 5a）。在存在ZmNAC11和ZmNAC29重组蛋白的情况下，探针的强烈移动物质转移电泳（EMSAs）被检测到（Fig. 5d）。值得注意的是，大籽粒NIL HKW9Mc中的探针含有完整的CACG基序，显示出比包含破坏基序的两个SNP的HKW9V671中的探针更强烈的移动（Fig. 5d）。接下来，我们研究了ZmNAC11和ZmNAC29蛋白对ZmEXPB15转录活性的影响，使用玉米叶原生质体中的荧光素酶（LUC）报告基因。使用一个包含两个CACG基序的436-bp ZmEXPB15启动子来驱动LUC（Supplementary Fig. 10a），ZmNAC11和ZmNAC29都激活了ZmEXPB15的表达（Fig. 5e）。一致地，来自HKW9Mc的启动子在存在NAC蛋白的情况下显示出明显更强的转录活性，而来自HKW9V671的则较弱（Fig. 5e）。此外，当使用包含另外四个CACG基序的较长的1308-bp ZmEXPB15启动子时，ZmEXPB15的转录显著增加，表明这两个NAC蛋白对启动子的结合更强（Supplementary Fig. 10b–d）。当同时表达ZmNAC11和ZmNAC29蛋白时，ZmEXPB15的激活没有明显改变（Supplementary Fig. 10e），表明这两个NAC蛋白之间没有相互作用。我们的研究结果表明，富集在胚乳中的ZmNAC11和ZmNAC29转录因子能够结合启动子并激活ZmEXPB15的转录。

ZmNAC11和ZmNAC29的突变引起了与zmexpb15相似的籽粒缺陷

为了研究ZmNAC11和ZmNAC29激活ZmEXPB15的重要性，我们调查了这两个NAC基因对籽粒性状的作用。使用CRISPR-Cas9在玉米C01近缘系中创建了敲除线（Supplementary Fig. 11a）。两个zmnac11敲除突变体（zmnac11-1和zmnac11-2）和三个zmnac29敲除突变体（zmnac29-1、zmnac29-2和zmnac29-3）都导致了保守的NAC结构域中氨基酸的缺失或框移（Supplementary Fig. 11b, c）。有趣的是，每个单突变株都产生了较小的籽粒，其HKW、籽粒长度和宽度明显减小，与分离的野生型同胞相比（Fig. 6a–d，Supplementary Fig. 11d–k）。zmnac11-1;zmnac29-1双突变株与每个单突变株相比没有显示出明显的增强效应（Fig. 6a–d），这表明这两个NAC可能在同一途径中起作用。这一推测与发现ZmNAC11转录本在zmnac29突变体中显著减少的结果一致，而ZmNAC29在失去ZmNAC11突变的情况下没有受到影响（Supplementary Fig. 12a, b）。所有这些结果表明，ZmNAC11和ZmNAC29都以积极的方式控制籽粒大小和重量，ZmNAC29也可能在ZmNAC11的上游起作用。

为了探索zmnac11和zmnac29的籽粒缺陷是否也与胚乳有关，对zmnac11-1;zmnac29-1双突变株的发育中籽粒进行了细胞切片和TUNEL分析。与野生型同胞相比，突变株在4和6 DAP时的胚乳面积明显更大，而胚乳面积较低（Fig. 6e, f），表明胚乳的消失被延迟了。与此一致，4-DAP的zmnac11-1;zmnac29-1籽粒中几乎不检测到TUNEL阳性核，而野生型胚乳中的信号较强（Fig. 6g）。然而，在较晚的阶段，TUNEL信号在6-DAP胚乳中在zmnac11-1;zmnac29-1（nac）双突变体和野生型之间无法区分。一致地，两个与PCD相关的基因AED1和SER1在nac突变体的籽粒中也显著下调（Fig. 6h, i）。此外，野生型雌穗与nac双突变雄花授粉所产生的F1籽粒的HKW显著大于nac雌穗与野生型花粉授粉所产生的F1籽粒（Supplementary Fig. 13a, b）。倒交试验结果表明，ZmNAC11和ZmNAC29也以母性方式控制籽粒发育。综上所述，这些观察结果表明，ZmNAC11和ZmNAC29通过促进胚乳消失来积极调控籽粒大小和重量，与ZmEXPB15类似。

ZmEXPB15与ZmNAC11和ZmNAC29在控制籽粒重量上存在遗传互作

为了探索zmexpb15、zmnac11和zmnac29之间的遗传相互作用，对zmnac11-2;zmexpb15-3和zmnac29-1;zmexpb15-3双突变体以及zmnac11-2;zmnac29-1;zmexpb15-3三突变体进行了研究。三个双突变体的HKW与分离的zmexpb15-3单突变体以及zmnac11-2和zmnac29-1单突变体相似（Fig. 7a, b）。根据我们的发现，ZmNAC11和ZmNAC29可以与ZmEXPB15结合并激活其转录，我们提出ZmEXPB15可能与ZmNAC11和ZmNAC29在控制籽粒重量上共同作用。这一假设得到了支持，因为在zmnac11和zmnac29突变体中ZmEXPB15的表达显著下降（Fig. 7c），而在zmexpb15突变体中ZmNAC11或ZmNAC29的表达没有明显改变（Supplementary Fig. 14a, b）。然而，与单突变体和双突变体相比，zmnac11;zmnac29;zmexpb15三突变体的HKW更低（Fig. 7a, b），这表明在ZmNAC11/ZmNAC29通过ZmEXPB15调控籽粒重量的过程中可能还涉及其他参与者。另外，这两个NAC TF和ZmEXPB15在控制籽粒重量上也可能有部分独立的作用。综上所述，我们提出ZmEXPB15可能至少在某种程度上与ZmNAC11和ZmNAC29在控制籽粒重量方面共同作用（Fig. 7d）。

玉米籽粒的大小和重量由胚胎、胚乳和母体组织的协调生长决定。目前关于玉米籽粒发育的研究主要集中在胚乳和胚胎的生长，对母体组织即胚珠的控制了解甚少。本研究提供了关于胚珠消失调控以及其对早期胚乳发育和籽粒相关性状的影响的见解。

玉米籽粒的大小和重量主要由早期胚乳的发育决定，在大约8天受精后，与遗传上不同的胚胎和胚珠组织协调发育22,32。早期胚乳的发育伴随着通过程序性细胞死亡（PCD）实现的胚珠的消失33,34，然而，在玉米中协调这些过程的关键基因和机制知之甚少。我们确定了ZmEXPB15作为百粒重QTL（HKW9）的候选基因，并显示它在2到8天受精后特异性地在胚珠中表达（图3a-c），与胚珠消失期相一致。通过在表达ZmEXPB15较低的小粒线（HKWV671和zmexpb15突变体）中观察到TUNEL信号的延迟出现和Evan's blue染色的减少，我们支持了ZmEXPB15在调控胚珠消失中的作用（图4j和补充图8）。这种延迟与PCD相关基因的下调有关（图4k）。已经提出在拟南芥中胚珠和胚乳的发育是对立的11，因为胚珠会退化以重新分配养分和空间来促进胚乳的发育3。与这些假设一致，我们观察到在胚珠发育受到影响的小粒线中，早在3天受精后，胚乳就较小了，而12天受精后，减小的程度更加明显（图4和补充图8）。这些观察结果表明，小粒线中胚乳发育的减小与胚珠PCD的时机差异直接相关，揭示了玉米中胚乳和母体组织之间相互作用的机制。与此同时，ZmEXPB15还促进了胚珠中细胞的扩张，这与其蛋白质定位和性质一致，导致了较大的胚珠体积。ZmEXPB15在胚珠细胞扩张和消失中的双重作用为我们理解胚珠组织生长如何与胚乳发育协调提供了窗口。我们的研究结果揭示了ZmEXPB15在早期胚乳发育中通过促进胚珠消失和细胞扩张发挥关键作用，填补了玉米中胚乳和母体组织之间的分子协调的知识空白。

只有少数基因已知在玉米的早期籽粒发育过程中发挥重要作用，从受精到约15天受精后23。大多数这些基因主要在6天受精后开始表达，因此它们在籽粒发育中的作用主要是通过调节早期胚乳的有丝分裂活性，或不同胚乳细胞类型的分化和功能来实现的。据我们所知，ZmEXPB15是唯一表现出胚珠特异性表达模式的基因，它通过促进胚珠PCD和消失来调控早期籽粒发育的独特过程。在谷类种子发育的早期阶段，胚珠是首个退化的母体组织，允许细胞内物质重新分配，以供胚胎和胚乳的发育13。ZmEXPB15功能的发现突显了胚珠在早期籽粒发育中的重要性。ZmEXPB15编码一个展开素蛋白，通过影响细胞壁的松弛参与各种生物过程35,36。我们发现ZmEXPB15蛋白质的定位与预期一样位于细胞壁中，这解释了其在胚珠细胞扩张中的作用（图3d，4a-c）。我们关于其在胚珠PCD过程中的作用的主要发现为我们提供了关于展开素蛋白功能的新视角，这可能与GFP-ZmEXPB15融合蛋白的胞浆和细胞核定位有关（图3d）。需要进一步的研究来阐明ZmEXPB15如何触发PCD过程的启动机制。

两个富集在胚珠中的NAC TFs，ZmNAC11和ZmNAC29，被确定为ZmEXPB15的潜在上游调节因子，深化了我们对ZmEXPB15分子功能的理解。我们的结果表明，ZmNAC11和ZmNAC29可能结合到ZmEXPB15的启动子来激活其表达（图5d，e），并在通过促进胚珠PCD来调节籽粒大小方面与ZmEXPB15发生上位性作用（图7d）。zmnac11;zmnac29;zmexpb15三重突变体在籽粒缺陷方面比单一或双重突变体更为严重（图7a，b），这表明这两个NAC TFs还调节其他与籽粒相关的基因。这一假设得到了支持，因为它们的表达更广泛，不仅在胚珠中，还在胚乳中（图5c）。我们发现的ZmNAC11/ZmNAC29-ZmEXPB15模块触发了胚珠的PCD过程，促进了其消失以适应胚乳的发育，还促进了其细胞扩张，揭示了玉米NAC-展开素模块在籽粒发育中的独特功能。这与最近在拟南芥中发现的一个NAC-展开素调节模块，NAC25/NAC1L-EXPA2，其作用是调节种子萌发时胚乳细胞的扩张，以及控制拟南芥从种子到幼苗的转变相似。NAC25/NAC1L直接激活EXPA2的表达，特异性地在胚乳中，促进细胞扩张37。在我们的研究中，ZmNAC11/ZmNAC29-ZmEXPB15模块特异性地在胚珠中发挥作用，促进了PCD过程和细胞消失，同时也促进了细胞扩张，揭示了玉米NAC-展开素模块在籽粒发育中的独特功能。

大多数与籽粒性状相关的基因是从具有严重缺陷的经典突变体中分离出来的，例如小型或皱缩的籽粒，不直接适用于育种。在这项研究中，我们基于一个百粒重（HKW）的QTL，HKW9，分离了玉米籽粒性状相关的基因ZmEXPB15。我们表明ZmEXPB15控制籽粒大小和重量，为优化玉米籽粒性状提供了资源。为了支持其潜在的育种价值，我们确定了一个ZmEXPB15的优良等位基因（Hap1），它具有增加的ZmEXPB15表达和HKW（图1j–l），可以通过分子标记辅助选择（MAS）应用于大籽粒品种的育种中。大籽粒NIL（HKW9Mc）通过增加百粒重、籽粒长度和宽度，而不明显改变其他农艺性状，包括淀粉含量，可用作改良其他自交系的大籽粒供体（图1a–e，补充图1）。此外，ZmEXPB15过表达增加了籽粒重量和大小，而且这种增加在与不同自交系的杂交组合中是一致的，没有明显的负面影响其他穗部性状。因此，我们的研究揭示了ZmEXPB15在分子育种中的潜在应用，以生成大籽粒种质，改善作物产量组分。

方法

NIL线的构建 两个优良的玉米自交系，Mc和V671，其籽粒分别较小和较大，用于对百粒重（HKW）QTL进行定位。利用F2:3家系，检测到了一个位于染色体9区域（bin 9.03–9.04）的主要QTL（HKW9），解释了超过10%的表型变异19。为了构建近等基因型线（NILs），将Mc作为回交亲本，通过4代回交和自交，将HKW9来自V671的等位基因引入到Mc背景中。结果产生了两个NILs，HKW9Mc和HKW9V671，分别携带自Mc和V671的HKW9座位。

籽粒性状测量

两个分别携带主要百粒重QTL（HKW9）座位来自Mc和V671的近等基因型线（NILs），HKW9Mc和HKW9V671，在不同地点进行了种植，采用随机区组设计，每个有三个重复。对于不同的转基因材料（如KO、OE、nac、nac-exp），稳定的F3或F4世代用于表型鉴定。选择每一行中间的受精良好的穗部进行籽粒相关性状的测量，包括籽粒长度和宽度，以及百粒重。使用Microsoft Excel 2010进行显著性检验和分析。使用尼康D7100相机捕获了穗部和籽粒的表型图像。使用GraphPad Prism 8软件生成箱线图和直方图。使用Yield-Trait Scorer (YTS-MKT, GREENPHENO)评分籽粒长度和宽度。选择每个穗部的中间部分的一百个籽粒进行百粒重的测量。使用Megazyme总淀粉测定套件（目录号：K-TSTA-50A）按照制造商的说明测量淀粉含量。