易基因2023年度DNA甲基化研究项目文章精选-526互联

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

2023年，易基因参与的DNA甲基化研究成果层出不穷，小编选取其中5篇不同方向的论文与您一起来回顾。

01、易基因微量DNA甲基化测序助力中国科学家成功构建胚胎干细胞嵌合体猴，登上《细胞》封面（cell / IF 64.5）

02、oxBS揭示复发性膀胱癌的DNA甲基化和羟甲基化变化并鉴定预测PD-L1表达标记物（Biomarker Research / IF 11.1）

03、WGBS等揭示SOX30甲基化在非梗阻性无精症中的表观遗传调控机制（Molecular Therapy-Nucleic Acids / IF 8.8）

04、单细胞DNA甲基化与转录组分析揭示猪生发泡卵母细胞成熟的关键调控机制（Cellular and Molecular Life Sciences / IF 8）

05、植入前胚胎的单细胞全基因组DNA甲基化和转录组分析揭示水牛胚胎基因组激活进展（Journal of Animal Science and Biotechnology / IF 7）

1、易基因微量DNA甲基化测序助力中国科学家成功构建胚胎干细胞嵌合体猴，登上《细胞》封面

发表杂志：cell

影响因子：64.5/1区

合作单位：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心，中国科学院广州生物医药与健康研究院等

北京时间2023年11月9日，《Cell》期刊以封面文章的形式在线发表了由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心，中国科学院广州生物医药与健康研究院等单位牵头，题为《Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells》(高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴)的研究论文，该研究在国际上首次成功构建了高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴，并证实了猴胚胎干细胞可以高效地贡献到胚外胎盘组织和生殖细胞。

深圳市易基因科技有限公司甲基化检测技术，继2022年为该研究团队助力完成《Nature》论文“Nature | 易基因DNA甲基化测序助力人多能干细胞向胚胎全能8细胞的人工诱导（点击回顾）”发表后，再次为研究者提供了微量全基因组甲基化测序技术（Micro-DNA WGBS），从表观遗传学层面证明发育过程中DNA甲基化的调控作用。

首先，研究者首先利用之前报道的人类原始造血干细胞(ESC)的提取方案，从17个E7(胚胎第7天)扩增囊胚中建立了9个猴原始造血干细胞系。之后选择了四种人类多能干细胞(PSC)培养基进行原始细胞到多能干细胞的转化：RSeT(基于NHSM24)、5iLAF、PXGL和4CL。此外，此研究还引入了LCDM，它可产生人类扩展潜能干细胞，这是一种分化能力更强的PSC。在每种条件下，此研究使用了5个引物猴ESC株系(2个雄性和3个雌性)进行转化。所有条件下的克隆均在2-4个传代内都出现了圆顶形形态(类似小鼠原始态胚胎干细胞)，但RSeT的形态变化较小，且使用4CL、RSeT和LCDM可将全部5个引物猴ESC株系成功转化为稳定的PSC，且经过20多次传代后表现出稳定的菌落形态。定量RT-PCR(RT-qPCR)分析表明，所有转化的ESC株系都表达经典的多能基因，其水平与原始ESCs相当。在所有转化的ESCs中，原始多能性基因的表达水平都不同程度地高于原始ESCs，其中在5iLAF和4CL培养的细胞中表达水平最高。KLF17、SOX2和NANOG的免疫染色进一步证实了这些发现。

此外，经RNA测序(RNA-seq)检测，在所有转化的ESC中，多个原始ESC富集基因下调，而在4CL和5iLAF ESC中，原始多能性网络被更强地激活。基因本体(GO)分析显示，在4CL和5iLAF ESCs中，与干细胞群体维持和DNA修饰相关的基因表达丰富，而在PXGL ESCs中，轴突导向和神经分化相关基因表达丰富。这些结果表明，4CL和5iLAF ESCs的原始状态稳定，但PXGL ESCs的幼稚状态不稳定，这反映了物种对这种培养基反应的特异性差异。然后，此研究通过基于液滴的单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究了猴子的原始ESCs和在4CL、5iLAF和PXGL培养的ESCs的发育状态。相关性分析和均匀流形近似与投影(UMAP)显示，4CL和5iLAF ESCs更接近于ICM和植入前的上胚层，primed ESCs更接近于植入后晚期的上胚层，而PXGL ESCs则同时位于这两个分组中(图1)。

图1. 在指定条件下培养的ESCs的免疫荧光图像以及原始多能性基因的表达水平和相关性特征。

由于DNA去甲基化是一种表观遗传学机制，通过这种机制，原始ESC可转化为幼稚多能状态，因此研究进行了微量DNA全基因组亚硫酸氢盐测序(Micro-WGBS)。结果表明，在RSeT、PXGL和LCDM中培养的ESCs的DNA甲基化水平较高(83%-86%)，与原始ESCs的水平相似；4CLESCs的水平较低(72%)，而5iLAFESCs的水平最低(52%)，4CL和5iLAFESCs显示的印记基因DNA甲基化模式与ICM更为接近(图2)。

图2. 在不同条件下以及不同培养期猴ESCs的表观基因组特征。

此研究还在4CL原始转化的不同阶段进行了全基因组甲基化分析，发现包括原始多能基因位点(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在内的所有基因组元件都出现了渐进的DNA去甲基化现象。另外，在4CL原始转换的不同时期进行了甲基化测序，发现包括原始多能基因位点(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在内的所有基因组元件都出现了逐渐的DNA去甲基化过程。此外，在转化过程中，一些印记基因的启动子区域也检测到了动态去甲基化(图3)。

图3. 在1、3、7和10个传代的原始条件和4CL原始条件下培养的ESC，在不同基因组区域，原始多能基因，原始多能性位点以及印记基因启动子区域的DNA甲基化水平。

以上研究证明了与在其他人类造血干细胞培养基中培养的猴子造血干细胞相比，4CL造血干细胞显示出更均衡的全基因组DNA去甲基化，同时具有原始多能基因的高表达水平和基因组稳定性。

为了提高注射早期猴胚胎中ESC的存活率，此研究对4CL造血干细胞的培养方案进行了优化并将体外培养干细胞注射到早期胚胎中形成嵌合猴胚胎，移植到代孕雌猴体内，成功培育出了活产嵌合体。在确认代孕雌猴怀孕的12例妊娠中，有4例流产胎儿和6例足月活产后代，其中包含一个流产的男胎(9号)和一个活产的男胎(10号)。而DNA甲基化水平异常是导致小鼠嵌合不良的一个众所周知的原因，为了深入了解9号嵌合猴流产和10号活产嵌合猴健康受损的情况，此研究选择ESC分化的和宿主胚胎分化的GFP序列信号阳性(GFP+)和GFP序列信号阴性(GFP-)的-成纤维细胞和骨髓细胞(BMCs)进行了微量全基因组甲基化测序(Micro-WGBS)以研究表观遗传学状态。GFP+BMCs的DNA甲基化水平(约80%)高于GFP-BMCs(约72%)这种高甲基化分布在不同的基因组区域。在GFP+和GFP- BMCs之间共鉴定出18,462个不同的甲基化区域，显示出高甲基化(hyperDMRs)，其中9%在启动子区域，870个显示出低甲基化(hypoDMRs)。对这些hyperDMRs对应的基因进行的GO分析表明，这些基因富集于与发育相关的生物过程，如解剖结构形态发生和系统发育。在与BMC相关的发育术语方面没有观察到实质性的富集。BMC中前100个表达基因启动子中的DNA甲基化水平在GFP+和GFP-BMC之间无显著差异。这些发现与GFP+和GFP- BMCs的单细胞转录组分析结果相当相似。此研究还分析了印记基因的DNA甲基化水平，发现GFP+BMCs印记基因启动子区的DNA甲基化水平略高。同时，此研究发现这些印记基因在GFP+和GFP-BMCs中的表达水平相似，这表明在用4CL ESCs生成的猴嵌合体中没有明显的基因组印记缺失，且与此研究观察到的猴原始ESCs中的DNA甲基化水平大大高于ICM中的DNA甲基化水平是一致的（图4）。

图4. GFP+BMC和GFP-BMC整体、TSS,TES，不同基因组区域的DNA甲基化水平以及GFP+BMC在整个注释基因组中高甲基化区域分布，启动子区域DNA甲基化水平与BMC表达基因与印记基因的表达水平聚类热图。

02、oxBS揭示复发性膀胱癌的DNA甲基化和羟甲基化变化并鉴定预测PD-L1表达标记物

徐州市中心医院（徐州医科大学徐州临床学院）史振铎等为第一作者、韩从辉教授为通讯作者在《Biomarker Research》杂志发表题为“Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression”的研究论文，该研究通过全外显子组测序、简化基因组甲基化测序（RRBS）+氧化简化基因组甲基化测序（oxRRBS）及对应的转录组测序（RNA-seq）等多组学方法揭示了复发性膀胱癌的甲基化和羟甲基化水平及相关转录变化，并鉴定出用于预测PD-L1表达的生物标志物。深圳市易基因科技为本研究提供oxRRBS+RRBS和RNA-seq测序服务。

标题：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression

时间：2023-01-13

期刊：Biomarker Research

影响因子：IF 11.1

技术平台：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外显子组测序等

背景：

膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，但其高复发率和对免疫治疗的响应机制仍不清楚，导致临床结果预测困难。表观遗传学变化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌进展中起着重要作用，且越来越多地作为诊断或预后预测的生物标志物进行研究。然而，由于此前传统的亚硫酸盐测序方法（RRBS）不能区分5mC和5hmC信号，导致关于羟甲基化知之甚少。

方法：

本研究使用多组学方法来绘制了原发性和复发性膀胱癌的基因组、转录组、DNA甲基化组和羟甲基化组图谱。

结果：

本研究通过全外显子组测序鉴定出参与UBC进展的的基因突变（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而这些基因突变中与UBC复发或PD-L1下调几乎不相关。整合RRBS和oxRRBS-seq数据，鉴定出在复发性膀胱癌中显著富集5hmC相关转录变化的脂肪酸氧化相关基因。在PD-L1高表达的膀胱癌样本中发现NFATC1（一种高度参与T细胞免疫应答的基因）基因体中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因组中的5mC和5hmC变化呈负相关，因此仅基于RRBS数据结合了5mC和5hmC信号，减弱了癌症相关信号标记，不适合用作临床生物标志物。

结论：

通过UBC样本的多组学分析，结果表明表观遗传变化比基因突变更多参与UBC复发和PD-L1调节，证明了使用DNA甲基化标记物预测膀胱癌患者免疫治疗反应的潜力。研究还表明仅仅采用RRBS方法联合检测5mC和5hmC水平会降低表观遗传生物标志物的预测准确性，揭示了使用oxRRBS-seq进行甲基化标记发现的优势。

图1：单碱基分辨率对膀胱癌样品进行5mC和5hmC分析。

（A）在膀胱癌样品中鉴定出的显著5mC和5hmC DMR数量。

（B） 5mC和5hmC DMR的基因组注释。

膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。

膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。

图2：复发性膀胱癌的5mC和5hmC分析。

（A）在复发性膀胱癌样品中鉴定出的5mC和5hmC DMR的数量（左），5mC和5hmC DMR的基因组注释（右）。

（B） RNA-seq用5hmC DMR标准化脂肪酸代谢相关基因数量。

（C）对TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特异性qPCR验证。

（D和E）复发性膀胱癌中的差异甲基化谱与组织收集后发生复发性UBC的5名患者之间的相关性。

图3：PD-L1高表达膀胱癌症的甲基化变化。

（A） PD-L1高表达膀胱癌症样本中鉴定的5mC和5hmC DMR数量（左），5mC和5hmC DMRs的基因组注释（右）。

（B） PD-L1高表达膀胱癌症样本中5mC DMR生物标记物的甲基化变化热图。

（C） PD-L1高表达膀胱癌中差异性5hmC水平和差异性5mC水平之间的相关性散点图。

图4：利用5mC生物标志物预测免疫治疗反应。

（A） TET基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化水平变化。

（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化预测PD-L1高表达的膀胱癌AUC评分。

（C）注释到NFATC1的5mC DMR轨迹图（左），预测PD-L1高表达膀胱癌的一种NFATC1-DMR预测AUC评分（右）。

03、WGBS等揭示SOX30甲基化在非梗阻性无精症中的表观遗传调控机制

不孕不育是生殖健康中非常严重的问题之一。约一半不孕不育由男性因素引起，其中约15%为精液中完全没有精子的无精症。无精症分为梗阻性无精症（obstructive azoospermia，OA，约占40%）和非梗阻性无精症（non-obstructive azoospermia，NOA，约占60%）。OA伴睾丸生精功能正常是由于排液管物理梗阻而不能产生成熟精子的结果；NOA是人类男性不育最严重的形式，是睾丸生精异常而无法产生睾丸精子的结果。截至目前超过80%的NOA病因不明。

越来越多的证据表明，生殖细胞中正常的甲基化模式与男性生育力高度相关。表观遗传学变化是否与NOA疾病相关尚不清楚。

2020年03月06日，陆军医科大学（第三军医大学）预防医学院毒理学研究所韩飞教授等为第一作者，曹佳教授、刘晋祎教授为通讯作者以"Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia"为题在《Mol Ther Nucleic Acids》杂志发表研究论文。该研究通过对OA和NOA患者之间的睾丸活检标本中的DNA甲基化进行全基因组比较分析，鉴定出SOX30为不孕不育的关键男性特异性因子，为人类NOA疾病的治疗提供了前瞻性靶点。深圳市易基因科技有限公司提供本研究的DNA甲基化测序（WGBS）分析服务。

标题：Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia（SOX30的表观遗传失活与男性不育有关，并为非梗阻性无精症提供了治疗靶点）

发表期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids

发表日期：2020年03月06日

影响因子：IF 8.8

技术：全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）等

样品：

睾丸活检标本取自OA和NOA患者（排除既往有睾丸损伤的患者）

OA对照组：从326名OA患者中选择15名年龄在20-42岁的OA男性作为对照组织

NOA测试组：从176名NOA患者中选择58名年龄在20-45岁的NOA男性，包括31例无精子（spermatozoa）NOA患者（NOA-I）、22例无精细胞（spermatid）患者（NOA-II）和5例无精母细胞（spermatocyte）NOA患者（NOA-III），提取DNA进行DNA甲基化分析

摘要：

非梗阻性无精症（NOA）是最严重的男性不育形式，然而NOA病因尚不清楚，导致缺乏临床治疗。本研究对NOA患者的DNA甲基化进行了全基因组比较分析，并将SOX30鉴定为NOA患者睾丸组织中启动子区域最显著的高甲基化基因。SOX30启动子高甲基化直接导致其在NOA中表达沉默，SOX30表达水平下调与NOA疾病严重程度相关。小鼠中Sox30缺失特异性的影响睾丸发育和精子发生，导致睾丸中完全没有精子，从而导致男性不育，但不影响卵巢发育和女性生育力。Sox30缺失小鼠模型的病理学和睾丸大小与NOA患者高度相似，成年期Sox30缺失小鼠中Sox30重新表达可逆转睾丸病理损伤并恢复精子发生。在Sox30缺失小鼠中重新表达Sox30后，重新发生的精子具有开始妊娠的能力。此外，Sox30重新表达的Sox30缺失小鼠的雄性后代仍能生育，这些雄性后代及其子代可以正常生活1年以上，且体貌与野生型小鼠相比无显著差异。综上所述，SOX30甲基化失活会特异性影响精子发生，可能导致NOA疾病，而SOX30重新表达可以成功恢复精子发生和实际生育力。本研究进一步加深了对NOA发病机制的理解，为NOA疾病的治疗提供了一个有希望的靶点。

图形摘要：SOX30与人类NOA疾病发展示意图

在出生后睾丸中，当启动子未甲基化时，SOX30高表达，精子发生正常。当启动子高甲基化时，SOX30表达沉默，精子发生受限，NOA疾病发展。

研究结果：

（1）SOX30在NOA患者的睾丸组织中高甲基化

图1：SOX30被鉴定为NOA睾丸组织中的高甲基化基因

A.与OA睾丸组织相比，NOA睾丸组织中不同基因区域的DNA甲基化水平。箭头表示NOA中的高甲基化区域。

B.通过全基因组DNA甲基化分析，将SOX30鉴定为NOA样品中5号染色体（Chr5）上的优先甲基化基因。Circos图显示OA和NOA样品中的Chr5甲基化模式。染色体区、GC水平，重复序列水平、基因序列水平、OA样本甲基化水平和NOA样本甲基化水平在Circos图中由外到内依次显示。箭头表示NOA样品中SOX30基因的优先甲基化位点。橙色框代表SOX30启动子。与SOX30表达负相关的高甲基化CpG位点用红色箭头表示。

C.NOA和OA患者的其他独立睾丸组织样本中SOX30差异甲基化位点的分层聚类。关键颜色条表示甲基化水平。NOA-S1、NOA-S2、NOA-S3、OA-S1、OA-S2和OA-S3分别代表NOA-Sample1、NOA-Sample2、NOA-Sample3、OA-Sample1、OA-Sample2和OA-Sample3。

表1：OA和NOA患者睾丸组织中的3号染色体、18号染色体和5号染色体启动子区DMR的高甲基化基因

（2）SOX30启动子高甲基化沉默与NOA高度相关

图2：通过高甲基化沉默的SOX30与NOA密切相关

A .三例OA（OA-S1，-S2，-S3）患者和三例NOA（NOA-S1，-S2，-S3）患者睾丸组织中差异表达基因（≥2倍）的分层聚类分析，以及SOX30作为NOA患者优先沉默基因的鉴定。颜色条表示mRNA表达水平。

B .在OA和NOA患者的睾丸活检标本中进行SOX30的IHC染色。NOA-I、NOA-II和NOA-III分别代表无精子的NOA患者，无精细胞的NOA患者和无精母细胞的NOA患者。箭头代表精子、精子细胞和精母细胞。标尺代表20μm。

C.在OA和NOA患者的睾丸活检标本中定量检测SOX30的IHC染色，****p＜0.0001。

（3）Sox30基因缺失会特异性的影响睾丸发育和精子发生，导致不育

图3：Sox30是男性生育和睾丸发育所必需的基因

A.分析不同Sox30基因型小鼠的生育力。+/+代表野生型小鼠（Sox30），-/+代表杂合小鼠（Sox30+/+-/+），-/-代表纯合小鼠（Sox30-/-）。

B.qRT-PCR和WB分析Sox30在具有指定基因型小鼠睾丸中的表达**p＜0.01。β-肌动蛋白用作内部对照。

C.在Sox30、Sox30+/+-/+和Sox30-/-小鼠中分别分析睾丸的形态和重量（Sox30:n=15，Sox30+/+-/+：n=19，Sox30-/-:n=14）**p＜0.01。

D.比较Sox30-/-小鼠在不同发育阶段（出生后40天、120天和180天[dpp]）的睾丸重量**p＜0.01。

E.从5个月以上的Sox30（n=10）、Sox30+/+-/+（n=10）和Sox30-/-（n=10）小鼠中显示附睾和睾丸切片的H＆E染色。附睾中的箭头表示精子。睾丸中的箭头表示精子和精细胞。

（4）Sox30-/-小鼠模型的病理学和睾丸大小与NOA患者相似

图4：Sox30-/-小鼠模型的病理学和睾丸大小与NOA患者相似

A.比较人NOA患者和Sox30-/-小鼠在6个月（n=10）和8个月（n=8）发育时期睾丸的H＆E染色。在6个月大的Sox30缺失小鼠中，几乎仅观察到精母细胞样细胞、精原细胞和支持细胞。在8个月大的Sox30缺失小鼠中观察到一些精母细胞样细胞，几乎只有精原细胞和支持细胞。

B.比较不同年龄NOA患者的睾丸体积。NOA-II+III（≤30）表示≤30岁的NOA-II和NOA-III患者，NOA-II+III（>30）代表＞30岁的NOA-II和NOA-III患者。

C.比较OA和NOA患者的睾丸体积****p＜0.0001。

（5）Sox30缺失导致的不孕症可通过Sox30重新表达来恢复生育力

图5：Sox30-/-小鼠的不育可以通过Sox30的重新表达来恢复

A.Sox30、Sox30+/+-/-和Sox30重新表达的Sox30-/-（Sox30loxp/loxp）小鼠的睾丸和附睾的H＆E染色。

B.在Sox30-/-小鼠中重新表达Sox30后，通过生育力分析评估重新发生的精子的生育力。

C.在Sox30（n=5）、Sox30+/+-/-（n=8）和Sox30loxp/loxp（n=14）小鼠中分析睾丸的重量。

图6：不同基因型小鼠睾丸的病理形态

A.Sox30\Sox30+/+-/-和Sox30重新表达的Sox30-/-（Sox30loxp/loxp）小鼠的睾丸和附睾的H＆E染色。

B-C. Sox30、Sox30+/+-/-和Sox30loxp/loxp小鼠睾丸中Sox30表达的qRT-PCR（B）和WB（C）分析***p＜0.001。β-肌动蛋白用作内部对照。

易基因小结：

本研究通过对OA和NOA患者睾丸活检标本的全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）分析，揭示了SOX30的甲基化失活会特异性地影响睾丸发育和精子发生，可能导致NOA疾病，SOX30重新表达可以成功恢复精子发生和实际生育能力。本研究为人类NOA疾病提供了重要的治疗靶点。

04、单细胞DNA甲基化与转录组分析揭示猪生发泡卵母细胞成熟的关键调控机制

在哺乳动物中，窦卵泡内的生发泡(germinal vesicle，GV) 卵母细胞可以保持数月或数年的静止状态。促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)激增促进了减数分裂（meiosis）恢复，使卵母细胞获得受精后和早期胚胎发育能力。同时还需要卵母细胞和粒细胞(granulosa cell，GC)之间高度复杂的激素和能量互相交流（Bi‑directional communication），以及内分泌和旁分泌信号的分子调控以促进细胞核和细胞质成熟。阐明窦卵泡中卵母细胞获得能力的分子程序对人类辅助生殖技术的成果和提高家畜生育能力具有重要意义，单细胞组学技术为阐明哺乳动物卵母细胞生长的早期分子机制提供了新的机会。

2023年7月22日，华南农业大学动物科学学院副教授袁晓龙博士等为第一作者在《Cellular and Molecular Life Sciences》期刊以“Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs”为题发表研究论文，该研究利用单细胞DNA甲基化测序（scBS-seq）和单细胞转录组测序（SMAART-seq2）等单细胞多组学分析技术揭示了猪生发泡卵母细胞成熟的关键调控机制，阐明哺乳动物卵母细胞从减数分裂停止到减数分裂恢复的分子机制。深圳市易基因科技有限公司提供本研究的单细胞DNA甲基化测序（scWGBS）和单细胞转录组测序（Smart-seq2）分析服务。

标题：Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs（单细胞多组学分析揭示了猪生发泡卵母细胞成熟的关键调控机制）

发表期刊：Cellular and Molecular Life Sciences

发表日期：2023年07月22日

影响因子：IF 8

技术：单细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）、单细胞转录组测序（Smart-seq2）等

研究摘要：

本研究以青春期母猪卵巢不同大小窦卵泡中的卵母细胞为研究对象，采用单细胞M&T-seq技术（scWGBS + Smart -seq2）对62个卵母细胞的细胞核DNA甲基化组和细胞质转录组进行平行分析。同时利用10×单细胞转录组分析了窦卵泡内细胞间互相交流机制。本研究开发了methyConcerto分析包以专门和全面表征单细胞甲基化谱和等位基因特异性甲基化。对猪窦卵泡中单个卵母细胞的基因表达和DNA甲基化进行了表征，活性和非活性基因体都显示出高甲基化水平，从而定义为两种不同类型的卵母细胞。尽管II型卵母细胞甲基化水平高于I型，但II型的细胞质转录本数量是I型的近两倍。此外，II型卵母细胞的印迹甲基化模式差异比I型大，II型卵母细胞的基因表达和DNA甲基化与MII卵母细胞更相似。粒细胞和II型卵母细胞之间的串扰活跃，这些观察结果表明II型卵母细胞更容易成熟。最后通过体外成熟实验进一步验证了胰岛素信号通路中的胰岛素受体底物-1（IRS1）是成熟的关键调控因子。本研究为哺乳动物卵母细胞减数分裂停滞和减数分裂恢复之间的调控机制提供了新的见解，同时还为未来的单细胞甲基化组学研究提供了新的分析包。

材料方法：

210日龄的青春期长白猪(Landrace,L)×大白猪(Yorkshire,Y)二元杂交母猪腹膜内注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）以刺激卵泡发育。48小时后从母猪身上解剖卵巢，分离出细胞质均匀的裸露卵母细胞并用1% BSA-PBS洗涤三次。用于免疫荧光实验的卵母细胞在–80°C下储存，直到进一步处理。用于单细胞实验的卵母细胞立即处理收集在8μL细胞裂解缓冲液中。

研究结果：

（1）细胞质的单细胞转录组分析（Smart-seq2）揭示母猪窦卵泡中两种不同的卵母细胞类

解剖4只青春期母猪的卵巢，并从5个不同大小的窦卵泡中分离出卵母细胞，共收集62个卵母细胞。根据其窦卵泡的大小将其分为五组：AF1代表窦形成阶段的卵母细胞（卵泡直径为0.5-1.8 mm），AF5代表排卵前卵泡（卵泡直径>7 mm）（图1A）。对每个分离的卵母细胞进行scM&T-seq测序，利用单细胞亚硫酸盐测序（scWGBS-seq）和Smart-seq2分别对分离的细胞核进行DNA甲基化和细胞质全长mRNA平行分析。转录组数据中，62个卵母细胞中的53个在质控后用于下游分析。平均每个卵母细胞获得8.68Gb数据。尽管窦卵泡大小不同，但5组卵母细胞直径和细胞质转录本数量（原始reads≥5）相对相似。主成分分析（PCA）显示，卵母细胞细胞质转录组不根据相应卵泡大小或遗传背景进行聚类（图1B）。

此外，结果不受测序数据量和比对率的影响，即使对于大小相似的卵泡，细胞质转录组图谱也呈现高度异质性，与此前报道一致。

不考虑相应的卵泡大小，应用scran R包中无监督聚类通过转录组进一步对卵母细胞进行分类。清晰的揭示出两个主要的卵母细胞簇：I型卵母细胞（n=25）和II型卵母细胞（n=29）（图1C）。这两种类型的卵母细胞具有显著不同的细胞质转录本数量，II型卵母细胞中平均有10418个基因，而I型卵母细胞中平均有5444个基因。与I型卵母细胞相比，II型细胞质转录本几乎是I型的两倍（图1D）。此外，每种类型的基因方差分布分析表明，II型卵母细胞的转录本在单个卵母细胞之间表现出更多异质性（图1E）。已知卵母细胞细胞类型特异性标记基因普遍表达，在新的两种类型之间没有差异（图1F）。此外，与II型卵母细胞相比，I型卵母细胞中与细胞死亡和凋亡相关的基因表达水平相似或更低，表明在I型卵母细胞中观察到的有限的基因表达不能归因于其不健康状态。这些观察结果确保上述卵母细胞类型不受任何技术或不必要的生物学混杂因素驱动。

图1：窦卵泡期，细胞质单细胞转录组（Smart-seq2）将猪卵母细胞分为两类

A.从窦形成期（AF1）到排卵前期（AF5），窦卵泡大小不同。

B.卵母细胞细胞质转录组的PCA分析不根据相应的卵泡大小进行聚类。

C.t-SNE分析（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding）显示基于图的细胞质转录组无监督聚类，揭示卵母细胞两个明确亚型。

D.每个卵母细胞细胞质中的转录本基因数量。

E.基因log表达在卵母细胞间的方差分布。

F.已知的六种卵母细胞类型特异性标记基因的表达水平。

ns不显著（p>0.05）。E/F采用Wilcoxon秩和检验

（2）两种不同类型卵母细胞的染色质结构和DNA甲基化

H3K4me3和H3K27me3是哺乳动物卵母细胞生长过程中与染色质结构相关的两个表观遗传标记。这两种类型的组蛋白修饰免疫染色显示，无论大小，窦卵泡中卵母细胞的染色质结构可能松散或紧密，即非包围核仁(non-surrounded nucleolus, NSN)或包围核仁(surrounded nucleolus, SN)。因此在相同大小的卵泡中卵母细胞的发育状态在染色质凝聚方面表现出异质性。

scBS-seq分析了50个卵母细胞的DNA甲基化状态，50个卵母细胞中有43个具有平行的细胞质转录组数据，包括21个I型卵母细胞和22个II型卵母细胞。平均每个卵母细胞产生44.4 Gb单细胞全基因组亚硫酸盐测序(scWGBS)数据(150 bp reads)，平均覆盖约11.40M(40.7%)CpG位点。考虑到scBS-seq甲基化状态的离散性，与常规WGBS-seq不同，作者开发了一个新的methyConcerto分析包，实现了EBMC（empirical Bayesian methylation caller）来鉴定甲基化胞嘧啶(mC)位点。由于两个样本对CG岛(CpG island,CGI) 的mC密度平均绝对误差(mean absolute error，MAE) 的不同定义，作者对这43个卵母细胞进行了无监督分层聚类分析。先前的研究揭示了非啮齿动物和啮齿动物之间的完全成熟卵母细胞(FGO)甲基化模式截然不同，为进一步表征I型和II型卵母细胞的甲基化模式，首先将本研究中的DNA甲基化和RNA表达样本合并创建“伪批量重复”(pseudo-bulk replicates)样本，发现基因体和CGI甲基化水平以及基因表达与猪FGO高度相关(相关系数≥0.80,p<2.2e−16)。将本研究中活性(TPM≥20)和非活性(TPM< 20)基因体甲基化分布与已发表的猪FGO和MII及小鼠FGO和MII的RNA-seq和DNA甲基化数据进行比较，发现猪卵母细胞中活性和非活性基因体的甲基化水平普遍较高，而小鼠卵母细胞在(伪)批量重复和单细胞水平下的非活性基因甲基化水平较低、活性基因甲基化水平较高。这些结果表明目前数据可靠。

根据转录组分类的两种类型卵母细胞的DNA甲基化水平在很大程度上不同（图2A）。因此，作者分析了两组卵母细胞在启动子区、CGI、CpG岛上下游2kb以内区域(CpG shore ,CpG岛岸)、CpG岛岸上下游2kb以内区域(CpG shelve,CpG大陆架)、基因和基因间区域（图2B）等不同基因组区域的mCG水平。分析结果表明启动子和基因间区外，其他区域的II型卵母细胞平均mCG水平显著高于I型卵母细胞（Wilcoxon检验；p0.75）区域和显著更少的低甲基化（<0.25）。在两种类型的卵母细胞中鉴定出1141个差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMR），其中99.91%（1140）的DMR在II型卵母细胞中甲基化水平高于I型。1140个DMR相关基因似乎在“细胞生长正调控”、“发育性细胞生长”、PI3K-Akt信号通路、mToR信号通路和长寿调控通路中显著富集。编码和非编码基因体的泛基因甲基化水平也显示出典型但不同的模式（图2C）。根据这一结果，II型卵母细胞细胞质中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B转录本数量显著高于I型卵母细胞（图2D）。II型甲基化密度高于I型，II型卵母细胞的活性和非活性基因体甲基化水平高于I型，且与MII型更相似（图2E）。将目前的基因表达和DNA甲基化数据与已发表的猪MII卵母细胞的RNA表达和DNA甲基化数据进行比较，发现II型卵母细胞与MII卵细胞更相似。因此，研究将II型卵母细胞分类为染色质结构为SN的成熟型卵母细胞，而将I型卵母细胞分类为染色质结构为NSN的未成熟型卵母细胞。

图2：猪卵母细胞DNA甲基化谱。

A.卵母细胞甲基化差异热图和分层聚类。两组卵母细胞差异为所有CpG岛甲基化水平的平均绝对误差(MAE)。

B.两组卵母细胞在不同基因组区域的mCG密度。顶部显示两组卵母细胞差异p值。

C.TSS上游10Kbp至TES下游10Kbp的平均甲基化水平。两种类型卵母细胞以及编码基因和非编码基因之间差异显著

D.编码DNA甲基转移酶的三个基因的Log表达水平。

E.16号染色体基因组视图举例说明了I/II型卵母细胞的不同模式。重新分析了已发表的猪完全成熟卵母细胞(FGO)和猪MII卵母细胞的大量数据比较。

Ns不显著(p> 0.05);*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，以此类推；B/D采用Wilcoxon秩和检验

（3）II型和I型卵母细胞的差异性等位基因特异性甲基化

图3：基因组广泛分布的ASM CpG揭示了猪卵母细胞中亲本和母本等位基因的普遍不对称性。

A.scBS-seq的ASM分析流程。

B.50个卵母细胞沿50 Kbp内计算所有卵母细胞的平均ASM水平（红点）和平均甲基化水平（蓝点）。两者之间有明显的对应关系。

C.两种类型卵母细胞生物学一致的ASM CpG（BCA-CpGs）数量和基因组分布。对角线数统计了每种基因组特征中BCA-CpG数量；非对角数统计了两种任意类型的基因组特征的BCA-CpG交集数量。

D.BCA-CpG相关基因的KEGG基因集富集分析（在启动子中至少5个BCA-CpGs）。部分重要基因通路（青色标记）也在差异表达基因中富集。

E.大量BCA-CpG仅在II型卵母细胞中检测到。

F.利用MEME中的SEA分析（Simple Motif Analysis）对不同类型的卵母细胞的BCA-CpG 52bp序列（CpG和25bp内）的motif富集

（4）比较细胞质转录组学揭示了卵母细胞成熟的关键基因通路

图4：猪卵母细胞的细胞质转录组及其与启动子DNA甲基化的协调作用。

A.II型卵母细胞中上调基因的KEGG富集通路分析。II型卵母细胞的转录增强表现出繁忙的信号通路和代谢增强成熟能力。

B.II型卵母细胞中上调染色质修饰和RNA代谢相关基因的表达水平（归一化z评分）。

C.转化Φ−1 CDF（the inverse of standard normal cumulative function）后的p值分布，检测细胞质基因表达和启动子甲基化之间的协调性。实际分布偏离了理论正态分布，并呈负偏态，表明部分基因的协调性。p＜0.005的基因被视为协调基因。

D.C的负协调基因中KEGG基因集富集分析（p<0.05）

（5）GC和II型卵母细胞之间的互相交流

图5卵泡GC75中的粒细胞与卵母细胞互相交流。

A.窦卵泡GC75体细胞10×单细胞基因表达谱的t-SNE分析。对三种主要细胞类型进行了注释。

B.用于注释细胞类型的六个典型标记的表达水平。

C.卵母细胞scM&T-seq的细胞质转录组的PCA分析。卵泡GC75中的卵母细胞Oocyte75为II型。

D.8种表皮生长因子在壁粒细胞（mGC）、丘粒细胞（cGC）和卵母细胞中的表达水平

（6）胰岛素信号通路在卵母细胞成熟中起关键作用

图6：体外成熟（IVM）实验对六种胰岛素信号通路相关因子的验证。

A. CellChat揭示的卵母细胞间DEG和参与卵母细胞-粒细胞互相交流的基因交叉ClueGO网络富集。“卵母细胞减数分裂”与胰岛素信号通路显著相关。

B. 卵母细胞样品的显微照片。有能力的卵母细胞恢复分裂，并挤压出第一极体（first polar body）。

C-D. 微注射45h后6个基因分别过表达（C）或敲低（D）的卵母细胞IVM成熟率。通过单Pearson卡方检验来检验与对照组的比率相等性。ns不显著，p>0.05；*p<0.05，**p<0.01；n=卵母细胞重复

研究结论：

细胞质转录组分析（Smart-seq2）结果显示，II型比I型卵母细胞具有显著更多的转录本，但卵母细胞的全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）分析结果表明II型卵母细胞甲基化水平显著高于I型。II型的印迹模式是渐进的，没有完全完成，GC和II型卵母细胞之间的串扰活跃，表明II型更容易成熟。通过体外成熟实验进一步验证了胰岛素信号通路中的IRS1是卵母细胞成熟的关键调节因子，也为未来的单细胞甲基化组学研究提供了新的方法学平台。

05、植入前胚胎的单细胞全基因组DNA甲基化和转录组分析揭示水牛胚胎基因组激活进展

水牛（Bubalus bubalis）是热带和亚热带地区重要的经济动物，但水牛产业的发展受到但其低繁殖力的极大限制。体外胚胎生产（in vitro embryo production，IVEP）和体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）等胚胎生物技术可以加速水牛的遗传育种，并促进水牛产业的发展。然而，低囊胚发育率（26.5%–39.48%）影响了其广泛应用。受精后，受精卵将发生卵裂，其发育将从母体过渡到合子，这一过程称为母源-合子转换（maternal-to-zygotic transition，MZT），与胚胎基因组激活（embryonic genome activation，EGA）相关。植入前胚胎在MZT过程中经历转录和表观遗传重编程高度变化。探索水牛植入前胚胎发育（pre-implantation embryo development，PED）与EGA相关分子机制具有重要意义。但水牛EGA过程中发生的转录和表观遗传复杂调控机制仍不清楚。

2023年7月11日，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室(广西大学) 伏彭辉博士和中国农业科学院深圳农业基因组研究所张杜博士为并列第一作者，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室(广西大学)石德顺教授和中国农业科学院深圳农业基因组研究所高飞研究员为共同通讯作者，在《J Anim Sci Biotechnol》杂志发表题为“Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes”的研究论文。该研究通过对水牛的生发泡（germinal vesicle，GV）卵母细胞、中期Ⅱ（metaphase II，MII）卵母细胞以及体外受精（in vitro fertilization，IVF）胚胎的7个关键阶段（受精卵、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚和囊胚内细胞团(inner cell mass ，ICM)）进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）分析，绘制了水牛植入前胚胎的转录组和DNA甲基化图谱。构建了水牛植入前胚胎发生的完整基因表达时间序列，阐明了水牛MZT过程中的EGA和遗传程序，鉴定了水牛MZT过程中关键的转录特征和表观遗传修饰，并深入了解了与EGA相关的分子机制。深圳市易基因科技有限公司提供本研究的单细胞DNA甲基化测序（scWGBS）和单细胞转录组测序（scRNA-seq）分析服务。

标题：Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes（植入前胚胎的全基因组转录组和DNA甲基化动态变化揭示了水牛胚胎基因组激活进展）

发表期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology

发表日期：2023年07月11日

影响因子：IF 7

技术：单细胞全基因组重亚硫酸盐测序（scWGBS）、单细胞转录组测序（scRNA-seq）等

研究摘要：

在哺乳动物植入前胚胎发育（PED）过程中，母源-合子转换（MZT）过程通过表观遗传修饰和基因表达来调控，并与胚胎基因组激活（EGA）有关。在MZT期间，胚胎对环境敏感，易在体外停滞。然而，水牛EGA的发生时间和调控机制尚不清楚。

本研究对水牛植入前胚胎进行基于单细胞的RNA-seq和全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），以绘制转录组和DNA甲基化图谱。水牛PED过程中分为四个典型的发育阶段。通过基因表达和DNA甲基化变化综合分析，在16细胞期鉴定出水牛的主要EGA。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了水牛母源-合子转换过程中的阶段特异性模块，并进一步揭示了关键信号通路和生物过程事件。这些通路的程序化和持续激活促进了水牛EGA成功。此外研究结果还表明hub基因CDK1在水牛EGA中起关键作用。

本研究绘制了水牛PED中的转录组和DNA甲基化图谱，并深入揭示了水牛EGA的分子机制和水牛MZT期间的遗传编程，这将为改善水牛胚胎的体外发育奠定基础。

图形摘要

研究结果：

（1）水牛植入前胚胎发育（PED）过程中的转录组图谱

图1：水牛PED过程中的转录组图谱。

A.水牛卵母细胞和胚胎的显微图像。上图为卵母细胞/胚胎及其透明带。下图为无透明带的卵母细胞/胚胎。从1到9：GV卵母细胞、MII卵母细胞、受精卵、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚、囊胚（下图中ICM从胚泡中分离）。

B.所有发育阶段转录本的主成分分析（PCA）。

C.无监督分层聚类和重复样本的热图。

D.水牛PED过程中连续发育阶段的DEG数量。

E.每个胚胎发育阶段母体基因表达抑制的数量。

F.每个胚胎发育阶段首次表达基因数量

（2）水牛PED过程中的DNA甲基化图谱

图2：水牛PED过程中的DNA甲基化图谱。

A.每个发育阶段的全基因组CpG甲基化水平。

B.CpG平均甲基化水平（基因体±5 kb）。

C.每个发育阶段CpG不同甲基化水平分布百分比。

D.水牛PED过程中连续发育阶段的DMR数量。

E.几个成对比较中，全基因组中的DMR分布（a：GV卵母细胞与MII卵母细胞；b：MII卵母细胞与受精卵；c：受精卵与2细胞；d：2细胞与4细胞；e：4细胞与8细胞；f：8细胞与16细胞；g：16细胞与桑椹胚；h：桑椹胚与ICM）。

F.以8细胞期为例，CpG甲基化水平与不同表达水平（高、中、低和不表达）相关的变化趋势

（3）WGCNA鉴定阶段特异性共表达模块

图3：利用WGCNA进行阶段特异性基因共表达分析。

A.共表达基因模块的聚类树状图。

B.共表达模块与胚胎发育阶段之间相关性的热图。

C.水牛PED过程中发育步骤示意图

（4）水牛EGA过程中的遗传程序动态变化

图4：主要EGA前富集KEGG通路的互作网络。六边形：2细胞期；矩形：4细胞期；三角形：8细胞期

图5：16细胞期的富集通路和重要KEGG通路分析。

A. KEGG通路在16细胞期富集。

B. 水牛PED过程中关键通路的全基因组激活

（5）关键hub基因的鉴定

图6：MZT过程中关键hub基因的鉴定。

A. 十大hub基因列表。

B. EGA过程中CDK1的调控通路和相关hub基因。

图7：CDK1富集生物过程的表达热图

研究结论：

本研究利用单细胞RNA-seq和单细胞WGBS技术对水牛卵母细胞和植入前胚胎的全基因组转录组和DNA甲基化进行了测序分析，绘制了水牛胚胎发生过程中的全基因组转录组和DNA甲基化图谱。根据基因表达的动态特征和DNA甲基化变化，揭示了水牛主要EGA发生在胚胎发育的16细胞期。在水牛MZT过程中，hub基因和信号通路的顺序激活对于水牛EGA和水牛PED的遗传编程至关重要。本研究为了解水牛胚胎发生的分子机制提供重要的补充信息，并为改善水牛胚胎的体外发育奠定了基础。

以上就是其中易基因2023年度5个不同应用方向的DNA甲基化研究项目文章精选，未来易基因将会有更多在DNA甲基化、RNA甲基化、染色质结构构象等表观组学研究成果展现，敬请期待。

参考文献：

1. Cao, Jing, Wenjuan Li, Jie Li, Md. Abdul Mazid, Chunyang Li, Yu Jiang, Wenqi Jia, et al. ‘Live Birth of Chimeric Monkey with High Contribution from Embryonic Stem Cells’. Cell 186, no. 23 (November 2023): 4996-5014.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.005.

2. Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.

3. Han F, Jiang X, Li ZM, Zhuang X, Zhang X, Ouyang WM, Liu WB, Mao CY, Chen Q, Huang CS, Gao F, Cui ZH, Ao L, Li YF, Cao J, Liu JY. Epigenetic Inactivation of SOX30 Is Associated with Male Infertility and Offers a Therapy Target for Non-obstructive Azoospermia. Mol Ther Nucleic Acids. 2020 Mar 6;19:72-83.

4. Yuan X, Chen N, Feng Y, Li N, Pan X, Tian Y, Wang J, Jiang Y, He D, Li J, Gao F. Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs. Cell Mol Life Sci. 2023 Jul 22;80(8):222.

5. Fu P, Zhang D, Yang C, Yuan X, Luo X, Zheng H, Deng Y, Liu Q, Cui K, Gao F, Shi D. Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes. J Anim Sci Biotechnol. 2023 Jul 11;14(1):94.