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肾上腺皮质癌（Adrenocortical carcinoma，ACC）是一种罕见的侵袭性肾上腺内分泌癌。在肾上腺皮质癌中，最近研究表明以CpG岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype，CIMP)为特征的亚型与特别差的预后相关。然而CIMP的驱动因素仍然未知。此外，CIMP与肾上腺皮质癌患者临床预后不良之间的功能关系尚不明确。
2023年8月2日，法国巴黎大学Valentina Boeva团队在《Clinical Epigenetics》杂志发表题为“DNA hypermethylation driven by DNMT1 and DNMT3A favors tumor immune escape contributing to the aggressiveness of adrenocortical carcinoma”的研究论文，该研究通过RRBS、RNA-seq等组学研究揭示了由DNMT1和DNMT3A驱动的DNA高甲基化有利于肿瘤免疫逃逸，从而导致肾上腺皮质癌侵袭。
标题：DNA hypermethylation driven by DNMT1 and DNMT3A favors tumor immune escape contributing to the aggressiveness of adrenocortical carcinoma（由DNMT1和DNMT3A驱动的DNA高甲基化有利于肿瘤免疫逃逸，从而导致肾上腺皮质癌的侵袭性）
时间：2023-08-02
期刊：Clinical Epigenetics（临床表观遗传学）
影响因子：IF 5.7 / 1区
技术平台： RNA-seq、RRBS等
研究摘要：
本研究通过RRBS、RNA-seq等分析结果表明肾上腺皮质癌（ACC）中的CIMP与DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3A高表达有关，而这主要由基因拷贝数的增加和细胞过度增殖驱动。此外，本研究验证了CIMP通过促进肿瘤免疫逃逸以促进肿瘤的侵袭性，而通过用去甲基化剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine）处理可以至少部分逆转这种效应。
本研究结果表明，与去甲基化药物联合治疗可能会提高免疫治疗的疗效，并可能为高CIMP肾上腺皮质癌患者提供一种新的治疗方法。
研究结果：
（1）ACC中的CIMP与DNMT1和DNMT3A高表达相关
图1：DNMT1和DNMT3A的表达水平在hCIMP-ACC中上调，并与拷贝数增加相关。
- DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2和TET3在TCGA数据集患者中lCIMP (n = 32)、iCIMP (n = 26)、hCIMP (n = 21)的表达水平（双侧t检验，***p<0.005）。
- 根据TCGA数据集的DNMT1或DNMT3A表达（分为高、中、低），利用Kaplan–Meier分析ACC患者的总生存率。
- 在含有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因的染色体中hCIMP-ACC和lCIMP-ACC的拷贝数变化模式。
- TCGA患者DNMT1和DNMT3A基因拷贝数状态的表达水平。
（2）拷贝数异常和增殖增加共同导致了ACC中DNMT高表达
图2：hCIMP-ACC肿瘤中细胞增殖增加可能是DNMT1和DNMT3A表达上调以及DNMT基因拷贝数畸变的第二驱动因素。
a-b. DNMT1（a）或DNMT3A（b）表达与细胞增殖之间的相关性；hCIMP样本（n=21，橙色），iCIMP（n=26，黄色）和lCIMP（n = 32，蓝色）。
c. 使用TCGA数据集的偏相关分析对DNMT基因的基因组拷贝数状态、细胞增殖和基因表达之间的相互依赖性进行建模。Rpartial表示在调控第三因素时计算的Pearson偏相关系数。
d-e. 分别用1µM或5µM的增殖抑制剂AZD-5438（AZD）处理hCIMP-ACC和lCIMP-ACC细胞系H295R（d）和MUC-1（e）48h后，分析对DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和增殖标记物MKI67表达的影响。使用DMSO作为载体。数据表示4个生物重复的平均值±SEM（Wilcoxon检验，*p<0.05，**p<0.01）。
（3）高CIMP和低CIMP肿瘤在增殖和免疫反应基因表达特征方面存在差异
表1：hCIMP和lCIMP样本的基因集富集分析(GSEA)结果比较
图3：hCIMP-ACC肿瘤的特征是肿瘤浸润免疫细胞丰度较低。
- 对TCGA数据集中hCIMP肿瘤中DNA甲基化抑制基因的通路富集分析。使用完整的KEGG通路数据集分析，图中只描述显著富集的通路。
- 在TCGA数据集的lCIMP (n=32)， iCIMP (n=26)和hCIMP (n = 21)样本中，使用mcp计数器计算肿瘤浸润的免疫和非免疫基质细胞群的相对丰度。使用Kruskal-Wallis检验比较每个种群的相对丰度，然后使用Benjamini-Hochberg校正的Dunn检验。***p < 0.001。
- 左：肿瘤浸润CD3+ T细胞百分比的定量。数据来自至少6个生物重复的平均值±SEM。Mann-Whitney U检验p=0.12。右：高浸润lCIMP样本和低浸润hCIMP样本的代表性截图
（4）用DNA去甲基化剂处理hCIMP-ACC细胞系可重新激活与免疫系统相关的基因
图4：去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-azacytidine, AZA)可以部分恢复hCIMP-ACC细胞系H295R中CpG岛的DNA高甲基化，恢复免疫应答基因活性。
- AZA处理后，H295R(5242个基因)、MUC-1(125个基因)和HUVEC(254个基因)细胞系中，存在显著上调或下调的基因重叠(FDR < 0.05)。
- 经5 μM AZA处理或未处理的3种细胞系(H295R, MUC-1和HUVEC)的启动子CpG岛甲基化情况，进行无监督分层聚类。使用甲基化水平变化最大的CpG (s.d. > 0.4)进行聚类分析。
- 在RRBS reads覆盖的CpG中甲基化CpG的整体百分比。AZA诱导三种细胞系CpG甲基化水平降低，但这种作用在DNA甲基化基础水平最低的MUC-1细胞系中不太明显。
- AZA诱导H295R基因启动子去甲基化的通路富集分析。与免疫应答相关的通路用红色突出显示。
- 位于两个免疫应答基因启动子H295R的差异甲基化区域(DMRs)示例。
研究小结：
本研究结果阐明DNMT1和DNMT3A高表达是基因拷贝数增加和细胞过度增殖的结果，构建了ACC中CIMP原因和结果的表型机制研究。此外，研究揭示了CIMP通过促进肿瘤免疫逃逸对肿瘤的侵袭性产生直接影响(图5)。且通过去甲基化剂AZA处理，这一作用可以至少部分逆转。总之，本研究结果强烈表明，DNA去甲基化药物和免疫治疗药物联合治疗hCIMP-ACC患者可能对患者生存产生积极影响。
图5：本研究提出了ACC高CIMP（hCIMP）的建立模型。DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3A在基因组畸变和过度增殖的驱动下表达增加，导致数百个基因启动子区DNA甲基化增加；因此，免疫应答相关基因的甲基化依赖性沉默导致免疫细胞对肿瘤浸润减少。
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参考文献：
Kerdivel G, Amrouche F, Calmejane MA, Carallis F, Hamroune J, Hantel C, Bertherat J, Assié G, Boeva V. DNA hypermethylation driven by DNMT1 and DNMT3A favors tumor immune escape contributing to the aggressiveness of adrenocortical carcinoma. Clin Epigenetics. 2023 Aug 2;15(1):121.
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