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叶酸作为一种必需B族维生素，是一种具有重要生物学功能（包括DNA甲基化调控）的甲基供体。正常的神经发育和生理对细胞叶酸水平很敏感，而叶酸缺乏或过量都可能导致神经系统疾病。最近已有研究表明叶酸与哺乳动物线粒体中tRNA m5C修饰和翻译有关。然而，叶酸摄入对神经元mRNA m5C修饰和翻译的影响在很大程度上仍然未知。
2022年11月23日，美国弗吉尼亚理工大学谢荷煌教授团队以“Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells”为题在《BMC Biology》杂志上发表研究论文，该研究通过RNA-BS和对应的RNA-seq测序分析揭示了叶酸对小鼠神经干细胞（neural stem cell，NSC）转录组范围内mRNA m5C甲基化和翻译的作用，并阐明了mRNA m5C甲基化和mRNA翻译之间的潜在联系。
标题：Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells（叶酸调节神经干细胞的RNA m5C修饰和翻译）
时间：2022.11.23
期刊：BMC Biology
影响因子：IF 5.4
技术平台：RNA-BS、RNA-seq、RT-qPCR、Western blot等
样本：
从侧脑室室管膜下区(SVZ)分离小鼠神经干细胞（NSC），将NSC放置在聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿中，并在第2天更换培养基将细胞培育4天。根据叶酸（FA）浓度将细胞分为三个处理组：低FA组（LF，1.5μmol/L）、中FA组（MF，10μmol/L）和高FA组（HF，80μmol/L），两个生物学重复，共6个mRNA-seq文库和6个mRNA BS-seq文库。
研究摘要：
本研究在三种不同浓度的叶酸中培养的NSC显示出不同的mRNA甲基化谱。尽管只发现了少数差异表达基因，但在叶酸缺乏或补充的神经干细胞（NSC）中发现数百个差异翻译基因。低浓度叶酸诱导的差异翻译基因与细胞质翻译和线粒体功能相关，而高浓度叶酸诱导的差异翻译基因与神经干细胞增殖增加相关。与总mRNA相比，多聚体mRNA中m5C水平高。此外，综合分析表明RNA m5C甲基化与mRNA翻译效率之间存在转录特异性关系。
研究结果
（1）不同叶酸浓度对小鼠神经干细胞中mRNA丰度的影响
（2）小鼠神经干细胞的整体m5C mRNA图谱
图2：mRNA BS-seq数据集中高置信度m5C位点表征。
- 两个重复之间m5C位点重叠维恩图。
- 两个重复之间重叠m5C位点的甲基化水平相关性点图。
- 两个重复中重叠和非重叠m5C位点甲基化水平箱线图。
图3：m5C修饰在小鼠神经干细胞总mRNA中的分布。
a-b. NSC中m5C位点(a)和m5C修饰(b)的mRNA占总mRNA的数量条形图。
c. NSC中总mRNA中m5C位点的甲基化水平箱线图。
- NSC中总mRNA中m5C位点附近序列标记。
- m5C位点沿mRNA转录本(5'UTR、CDS、3'UTR)分布密度图。显示mRNA m5C位点百分比的移动平均值。
- 三种不同浓度叶酸条件下(LF、MF、HF) m5C位点重叠维恩图。
- m5C修饰的mRNA在LF、MF和HF中的GO分析气泡图
（3）叶酸以剂量依赖性方式诱导mRNA翻译变化
图4：叶酸缺乏和补充影响NSC的mRNA翻译。
a-b. 分离无核糖体和结合核糖体RNA的蔗糖梯度示意图(a)和254nm下记录的代表性polysome图谱(1.5μM FA，replicate 1)的部分polysome (9-15部分)(b)。
c. LF和MF之间的差异翻译基因(DTGs)的比较火山图。
d. HF和MF之间差异翻译基因(DTGs)的比较火山图。
e. DTGs的GO分析气泡图，LF的翻译效率降低(LF vs MF下调)，HF的翻译效率降低(HF vs MF下调)，HF的翻译效率增加(HF vs MF上调)
（4）叶酸诱导polysome mRNA m5C甲基化水平变化
图5：叶酸对小鼠NSC polysome mRNA m5C甲基化的影响。
- Polysome mRNA中m5C位点附近序列的序列频率标志。
- m5C位点沿mRNA转录本（5′UTR、CDS、3′UTR）分布密度图。显示百分比的移动平均值。
- Polysome mRNA中m5C位点甲基化水平方框图。
- pMF和pLF之间差异甲基化m5C位点的甲基化水平比较热图。两个生物学重复（R1、R2）。
- pMF和pHF之间差异甲基化m5C位点的甲基化水平的比较热图。两个生物学重复（R1、R2）。
- pMF vs pLF和pMF vs pHF mRNA DMS修饰的GO注释。
（5）m5C修饰与mRNA翻译相关性
图6：m5C甲基化与mRNA翻译相关性。
a–c. 总mRNA和Polysome mRNA之间的差异甲基化的m5C位点甲基化谱热图。
d–f. 总mRNA和Polysome mRNA之间的差异表达基因（DEG）Volcano图。
g–i. m5C甲基化水平显著变化的mRNA分布，分三类：m5C甲基化与mRNA翻译效率之间的正相关、负相关和中性相关。
j. 不同m5C甲基化mRNA翻译相关类别位点分布的堆积条形图。
k. 三种不同叶酸浓度条件下m5C甲基化和mRNA翻译之间具有一致正/负/中性相关性的转录本汇总表。
研究结论
本研究通过RNA-BS和RNA-seq联合分析表明了叶酸对NSC转录组范围内mRNA m5C甲基化和翻译的作用，并揭示了mRNA m5C甲基化和mRNA翻译之间的潜在联系。m5C甲基化调控mRNA翻译的机制值得使用体内模型进行进一步研究。
关于易基因RNA m5C甲基化测序(RNA-BS)技术
m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。
易基因提供适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：
- 常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。 - 常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：
易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。
技术优势：
- 高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；
- 高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；
- 单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。
- 高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。
研究方向：
- 与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。
- 此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。
实验策略：
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案。
参考文献：
Xu X, Johnson Z, Wang A, Padget RL, Smyth JW, Xie H. Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells. BMC Biol. 2022 Nov 23;20(1):261.
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