小组成员及分工：
组长-封徐杰-选定课题组研究相关的生物信息学文献，组织讨论文献中内容以及分析工具和方法，博客的最终提交；
组员-李震-负责文献大部分的翻译工作；
组员-庹冉-负责文献中采用的生物信息学方法的介绍；
组员-江思近-负责博文初稿的进一步润色。
- 介绍
植物乳杆菌，以前被命名为"植物乳杆菌"，在各种各样的环境中被发现，表现出高水平的种内遗传多样性。为了研究菌株多样性，我们对54个全基因组序列进行了比较基因组分析。结果表明，L. plantarum subsp. plantarum被分为A、B和C 3个谱系，在对益生菌活性有益的基因中，只有与L . plantarum特异性细菌素植物乳杆菌素( Pln )生物合成相关的基因在谱系间存在显著差异。与plnE / F生物合成相关的基因在三个谱系中都是保守的，而外群没有任何Pln产生基因。在谱系C中，最深的祖先型分支pln E / F基因保守性较好。在谱系B中，由于pln位点的可移动元件，观察到基因功能的丧失。在谱系A中，大多数菌株被预测通过拥有不同的Pln编码基因产生一种以上的Pln。这些结果表明L . plantarum subsp . plantarum中存在由三岔分支进化而来的功能多样性，并证明Pln是区分三个谱系的指标。
Fig1. 54株植物乳杆菌的比较基因组学分析——进化树
“Lactobacillus plantarum”被重新分类为植物乳杆菌，目前包括2个亚种，即L . plantarum subsp . plantarum和L . plantarum subsp . argentoratensis。植物乳杆菌因其健康益处和安全使用的历史而被广泛用作益生菌。由于植物乳杆菌( Lactiplantibacillus )存在于人体正常菌群中，在控制病原体方面具有辅助作用，因此其在微生物组治疗产品开发中的应用有所增加。植物乳杆菌被用于蔬菜和乳制品的发酵，在世界范围内的多种发酵产品中都有发现。由于植物乳杆菌在不同的生境中被发现，它以不同的方式进化，因此在这个物种中发现了高水平的种内遗传多样性。菌株的多样性可能有利于工业应用，但不利于食品的安全性。目前正在利用比较基因分析对此进行更深入的研究。
根据前人的研究，植物乳杆菌基因组( 3.3 Mb )大于其他乳酸菌( LAB ; 2 ~ 2.7 Mb)的典型基因组。植物乳杆菌庞大的基因组表明其种内遗传多样性水平很高，而这一特性被认为是由于该物种的游牧生活方式，生活在多种生境中，具有较大的代谢多样性。由于种内多样性水平较高，基于简单性状对植物乳杆菌菌株进行分类并不容易。以往的比较基因组学分析研究一致表明，植物乳杆菌的进化与该物种的分离来源或菌株的地理位置无关。然而，在植物乳杆菌菌株之间发现了少数基因簇的差异。Siezen等在2011年对6株菌进行分析，发现菌株间前噬菌体、IS元件、转座酶和植物乳杆菌素( Pln )生物合成基因存在较大差异，且荚膜多糖和胞外多糖生物合成基因存在较大变异。2016年，马蒂诺等利用54株菌株分析了直系同源基因的存在/缺失，证明植物乳杆菌菌株根据其胞外多糖、分泌组和糖代谢分为两个表型簇。2018年，Choi等研究表明，根据碳水化合物利用、毒力和代谢，108株菌可分为5个表型簇。2017年Yu等对23株菌的比较表明，很少有菌株进化出含有成簇的规律间隔短回文重复区域、抗菌活性和解毒活性。然而，这些研究大多基于某些功能基因将菌株划分为表型簇；因此，他们没有基于系统发育关系对基因簇进行检验。
细菌素是由广泛的原核生物产生的窄谱或广谱抗菌肽，分为几类。许多乳酸菌产生的细菌素可应用于食品保鲜或食品安全应用。最近，细菌素被预测通过维持胃肠道微生物群中细菌的平衡和影响宿主免疫系统对人体肠道产生积极作用，这可能在疾病治疗和健康改善方面具有价值。已知植物乳杆菌能产生Ⅰ类和Ⅱ类细菌素，包括Plns A - Y、NC81F、NC8HK和NC8βα。最近发现了一个新的植物乳杆菌菌株，该菌株含有编码不同细菌素的基因，而不是传统的植物乳杆菌素，并且具有广泛的抑制谱。植物乳杆菌产生的细菌素可以通过抑制金黄色葡萄球菌和李斯特菌等病原菌的生长来减少胃肠道疾病，并且具有抑制食品腐败的作用。因此，植物乳杆菌产细菌素是益生菌菌株选择的重要标准之一。
本研究旨在从系统发育的角度探讨植物乳杆菌的进化趋势。我们首先进行系统发育基因组学分析，仅根据系统发育关系对L . plantarum subsp . plantarum进行物种细分，旨在确定某些功能基因是否可以用于区分种内基因簇。我们只使用完整的基因组序列，试图最小化由于使用低质量的草图基因组而产生的分析误差。我们关注了多种功能基因，包括与碳水化合物利用和物质生物合成相关的基因，以确定各组之间是否存在显著差异，并预测这种差异是否会影响每个亚群作为益生菌的作用。
- 结果
对54株植物乳杆菌L . plantarum subsp . plantarum进行全基因组测序，发现其基因组大小在2.95 - 3.70 Mb之间，G + C含量在44.08 - 44.93 %之间，编码序列( coding sequence，CDS )数目在2729 - 3478之间。在所研究的54株菌中，41株除染色体外还含有质粒。核心基因组由2207个直系同源基因家族组成，泛基因组由7323个直系同源基因家族(附图S1A)组成。基于Heaps ' Law模型的开放性估计表明，L. plantarum subsp. plantarum泛基因组具有开放性，参数( γ )为0.66 。据估计，每增加一个物种的新基因组信息，大约40个新的基因家族将被添加到泛基因组中。
从所研究的56个基因组中，包括外群，提取了1884个直系同源单拷贝核心基因集。将其拼接成由553，499个氨基酸组成的序列，并使用Jones - Taylor - Thornton模型构建该序列的最大似然树。系统发育分析表明L . plantarum subsp . plantarum进化为谱系A、B和C (附图S2)。谱系A由32个基因组组成，谱系B由15个基因组组成，谱系C由7个基因组组成。
为了评估不垂直进化在该物种中的发生，在直系同源基因存在或不存在的情况下，使用二进制矩阵生成网络树。分析表明，3个谱系在网络树中也发生了分化。除个别菌株外，各谱系中的大多数菌株均表现出谱系内水平的基因转移，支持植物乳杆菌植物亚种三芯分支进化的理论。
Fig.1 植物乳杆菌三叉进化论
编码Pln的基因是植物乳杆菌植物亚种三芯分支进化的功能指示器。Pln相关基因只在L . plantarum subsp . plantarum中观察到。姊妹亚种L . plantarum subsp. argentoratensis或外群L . paraplantarum不具有任何Pln产生基因。在植物乳杆菌L . plantarum subsp . plantarum中鉴定到的多种pln基因中，只有plnE / F基因在三个谱系中均有表达，表明植物乳杆菌L . plantarum subsp . plantarum的共同祖先具有这些基因。
在最深的支系C中，plnE / F基因在plnEFI操纵子中高度保守，在该支系的pln位点中没有观察到可移动元件(图3 )。肠球菌素X链β编码基因在谱系C中频繁出现，但由于缺乏链α编码基因而显得无功能。在谱系B中，由于许多pln基因被移动元件(转座酶和整合酶)移码、截短或破坏，导致基因功能丧失。在谱系A中，存在多种Pln编码基因，包括pln A、pln Q、pln E / F、pln J / K和pln N。比较Pln操纵子位点在基因组中的位置，发现Pln生物合成基因被组织成操纵子，且在谱系A中高度保守。除两株( Zhang - LL和TMW 1.708)外，所有属于谱系A的菌株均预测产生一种以上的Pln。
在L . plantarum subsp. plantarum NC8中发现的plNC8βαc操纵子在5株plnMNOP和plnJKLR操纵子缺失的菌株中被观察到，并发现了一定的移动元件序列。plNC8 - IF和组氨酸激酶( HK )不编码Pln，但通过编码诱导因子( IF )和HK控制细菌素的产生。上述5株菌均具有plNC8βαc操纵子以及IF和HK基因，而其他菌株均不具有。与pln基因不同的是，pln NC-8 α / β操纵子和pl NC8 - IF与HK似乎不是来自一个共同的祖先，而是在进化过程中很可能通过移动元件引入基因组。
除上述Pln外，还有少量细菌素基因被零星观察到，独立于谱系。这些基因包括在L . plantarum subsp.plantarum NC8中发现的与pln NC-8 α / β相关的基因和与肠球菌素相关的基因。pln NC-8α / β操纵子在5株菌中均有发现，各谱系间的频率无差异。在所有含有pln NC-8α / β操纵子的菌株中，pln MNOP和pln JKLR操纵子被删除，在pln NC-8α / β操纵子下游发现少量移动元件序列。这表明，与pln基因不同，pln NC-8 α / β操纵子并非来自共同的祖先，而是来自不同的物种，是该物种最近通过横向基因转移获得的。此外，某些菌株含有除Pln以外的细菌素生物合成相关基因，这些基因存在于质粒上，而不是其染色体。
Fig. 2 Plantaricin gene (pln) loci observed in the 54 complete genomes of Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum
分析3个谱系中与以下作用相关的感兴趣功能基因的差异：( 1 )碳水化合物的利用，( 2 )人乳寡糖( HMOs )的利用，( 3 ) SCFA生物合成，( 4 )乙偶姻生物合成，( 5 )维生素生物合成，( 6 ) γ -氨基丁酸( GABA )生物合成，( 7 )醇降解活性，( 8 )抗氧化生物合成，( 9 )非核糖体肽合成酶( NRPS )和聚酮合酶( PKS )生物合成，( 10 )抗生素抗性。分析结果显示，这些功能基因在3个谱系的菌株之间没有差异。
3 讨论
本研究旨在通过对多种来源的植物乳杆菌L . plantarum subsp . plantarum进行比较基因组学分析，研究其种内功能多样性。结果表明，核心基因组和泛基因组的大小表现出与以前使用草图基因组进行分析的研究中相似的模式。基因组和系统发育分析支持植物乳杆菌L . plantarum subsp . plantarum菌株分为谱系A、B和C。然而，从西方国家分离的菌株大多属于谱系A。对于其余的，菌株的地理定位在几个具有坚实聚类的亚分支中观察到。在某些乳酸菌中，分离源与糖代谢性状相关；但与植物乳杆菌L . plantarum没有相关性，本研究也发现了类似的结果。
三个谱系之间唯一的差异是细菌素编码基因的存在。本研究中观察到的两种主要植物乳杆菌素分别为Pln EF (在谱系A和C中)和JK (在谱系A中)。两种植物乳杆菌素均在目标菌的质膜上形成孔道，但表现出互补的离子选择性。Pln EF孔对阳离子表现出高导电性而对阴离子不导电，而Pln JK孔对阴离子导电良好而对阳离子不导电。因此，在同时具有互补细菌素的菌株中，杀灭效率得到增强。这暗示了在竞争性微生物群落中，谱系A对谱系B或C的适应性更强。在谱系B中观察到由于可移动遗传元件导致的基因功能丧失，表明与细菌素生物合成相关的基因逐渐丧失。推测植物乳杆菌植物亚种L . plantarum subsp . plantarum的共同祖先具有Pln E / F，且该特征在深层分支(谱系C )中得以保留。子代类型进一步分裂为两个谱系( A和B)，这两个谱系的进化明显分化。谱系A获得多样的pln基因和GH20基因，在与HMOs竞争的环境中进行适应性进化，而谱系B则适应于不需要Pln的环境。
有趣的是，谱系A以发酵食品来源为主( 75 % )，谱系B以环境或肠道来源为主( 60 % )。此外，谱系C的菌株均来源于发酵食品来源。众所周知，当环境中细胞密度较高时，细菌素在介导种群和群落水平的相互作用中的关键作用得到了保证。细菌在密集的群体中利用细菌素与紧密的细胞竞争，但在细胞密度较低的环境中不需要产生细菌素。由此推测，谱系A和C菌株通过拥有细菌素基因进化并适应了发酵食品的高细胞密度，而适应自然环境的谱系B菌株正在丢失不必要的基因。
本研究表明，3个家系对糖的利用没有差异。前期研究发现基于单核苷酸多态性系统发育树分类的两组植物乳杆菌在低聚果糖和棉子糖利用方面存在差异。同样，一项基于糖基因位点进行层次聚类的研究报告了糖代谢相关基因在聚类之间的差异。然而，这些研究根据直系同源基因或糖利用基因的存在与否来划分聚类，而本研究中的系统发育树是基于全基因组绘制的。因此，无法直接将我们的结果与这些研究的结果进行比较。
在几个发酵环境中，细菌素在系统发育分支中的分布已经被研究。Gontijo等发现细菌素结构基因的分布与手工奶酪乳酸菌种的系统发育分支有关，在某些特定的分支中频率较高。Azevedo等报道了不同种类的细菌素在瘤胃细菌和古菌系统发育分支中的出现。Collins等报道了乳酸菌属复合体中细菌素基因的多样性和复杂性。以往的研究主要关注细菌素产生基因的种间遗传多样性，而我们的研究主要关注商业重要物种的种内分布。
植物乳杆菌产生细菌素是其作为天然食品防腐剂和膳食补充剂的潜在用途的一个指标。因此，在Pln产量方面，谱系A中的菌株似乎比谱系B和C中的菌株具有更好的细菌群落控制能力。以往关于植物乳杆菌的比较基因组学研究没有考虑进化谱系和分离来源之间的联系。细菌素基因的差异分布和三芯分支谱系固有的偏向性生态起源暗示了该物种发生了生境适应进化。
参考文献：
Choi, S., Baek, Mg., Chung, MJ. et al. Distribution of bacteriocin genes in the lineages of Lactiplantibacillus plantarum. Sci Rep 11, 20063 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-99683-1