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肾细胞癌（RCC）是最常见的肾癌亚型，每年超400万例新发病例，是泌尿系统恶性肿瘤导致的第二大死因。2%-70%的RCC为透明细胞RCC（Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。DNA甲基化（DNA methylation，DNAm）是主要的表观遗传修饰之一，在维持基因转录和基因组稳定性方面具有至关重要的作用。DNAm在ccRCC的发病机制中起着重要作用，许多研究集中于DNAm异常变化与ccRCC预后之间的相关性，但基于DNAm驱动基因的ccRCC预后模型鲜有报道。
2023年6月7日，南方医科大学附属龙华人民医院泌尿外科邓琼研究员等在《BMC Genomics》发表题为“Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma”的研究论文，该研究以ccRCC患者的DNA为对象，通过简化基因组重亚硫酸盐测序（RRBS）等技术方法，鉴定出ccRCC患者的ccRCC早期诊断和预后的DNA甲基化生物标志物。深圳市易基因科技有限公司为本研究提供RRBS建库测序分析服务。
标题：Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma（基于DNA甲基化驱动基因的肾透明细胞癌预后模型的鉴定和验证）
时间：2023-06-07
期刊：BMC Genomics
影响因子：IF 4.4
技术平台：RRBS等
摘要：
肾透明细胞癌（ccRCC）是一种形态异质且预后不良的恶性肿瘤。本研究旨在建立DNA甲基化（DNAm）驱动的ccRCC基因预后模型。本研究对ccRCC患者的DNA提取物进行了RRBS测序分析。对10对患者样本的RRBS数据进行分析以筛选候选CpG位点，然后训练并验证18个CpG位点模型，并结合临床特征建立了用于ccRCC预后或风险评估的列线图（Nomogram model）模型。研究在启动子区域鉴定出2261个DMR。经DMR筛选后，共筛选出578个候选基因，与450K芯片中的408个CpG二核苷酸相对应。从TCGA数据集中收集了478个ccRCC样本的DNAm图谱。通过单因素Cox回归、LASSO回归和多因素Cox比例风险回归分析对319个样本的training集进行分析，共鉴定出18个CpG的预后组。结合临床特征构建了预后模型，在测试集（test set，159个样本）和整组（whole set，478个样本）中，Kaplan-Meier曲线差异显著；ROC曲线和生存分析显示AUC＞0.7。结合临床病理特征和甲基化风险评分的列线图表现较好，决策曲线分析也显示出有益的效果。
本研究深入了解了高甲基化在ccRCC中的作用。鉴定出的靶标可作为ccRCC早期诊断和预后判断的生物标志物。本研究对更好的风险分层和个性化治疗具有重要意义。
研究结果
（1）RRBS质控结果
图1：样本间全基因组甲基化差异。
- 样本中CpG甲基化水平相关性。较大的圆形区域和较深的颜色表示高相关性。
- 聚类树状图。根据欧几里得距离，使用R.Ward.d2的hclust函数对样本进行聚类。选择最小方差方法作为聚类方法
（2）DMR鉴定
图2：DMR分析
- 平均甲基化差异。X轴代表甲基化差异。负值表示低甲基化。正值表示高甲基化。Y轴表示相应横坐标的DMR数量。
- DMR甲基化分布密度。X轴代表Ca组中的DMR甲基化水平；Y轴代表对照组中的DMR甲基化水平。DMR密度从低到高（白色到红色）。
- DMR在基因元件上的分布
（3）ccRCC预后模型构建
图3：差异甲基化CpG（differentially methylated CpG，dmCpG）位点鉴定。
A、 使用调谐参数（lambda）对CpG位点进行LASSO回归分析。
B、 蛋白质-蛋白质互作。
C、 18个dmCpG位点的DisGeNet疾病富集分析。
D、 18个dmCpG位点的GO富集分析
表5：预后模型中18个CpG位点的注释
（4）预后模型的Training
图4：training集中的风险评分
- 高风险组和低风险组患者的KM生存曲线。数据显示为四分位间距的中位数。使用Log-rank检验评估统计学显著性。虚线显示50%生存概率的显著性。
- 计算高风险和低风险患者的风险评分和生存状态等级。虚线显示区分ccRCC高风险和低风险患者的临界值。
- C.18个CpG位点甲基化水平热图。
- 风险评分的1年、3年、5年和10年ROC曲线。以临界值决定该模型的敏感性和特异性
图5：test集中的风险评分
（5）预后模型的验证
图6：基于预后模型和临床特征的列线图
预后模型和临床特征的单因素（A）和多因素（B）回归分析。（C）预测ccRCC患者1年、3年、5年和10年生存时间概率列线图
图7：模型校准和ROC评估
- 高风险组和低风险组患者的KM生存曲线。
- 预测ccRCC患者1年、3年、5年和10年总生存期（OS）的列线图。
C-F. 1年（C）、3年（D）、5年（E）、10年（F）的临床病理特征（绿色，与肿瘤分期诊断、年龄和肿瘤组织学分级相结合），RiskScore（红色）和NomoScore（黑色）的ROC曲线
结论
本研究分析了患者样本中的RRBS数据以筛选原始候选CpG位点，然后利用TCGA-KIRC数据训练和验证了18个CpG位点模型，并结合临床特征建立了用于ccRCC预后或风险评估的列线图模型。
基于该结果，研究开发并验证了这种新型预后模型是一种实用、可靠的ccRCC患者预后工具。本研究结果支持异常DNAm变化与肿瘤发生密切相关的观点，并为ccRCC提供了潜在的新型预后生物标志物，对更好的风险分层和个性化治疗具有重要意义。
关于易基因简化基因组甲基化测序研究解决方案
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。
技术优势：
- 起始量：100ng gDNA；
- 单碱基分辨率；
- 多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；
- 针对性强，成本较低；
- 基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。
应用方向：
RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：
- 队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选
- 复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
- 模式动物发育和疾病甲基化研究
| 技术参数 | RRBS | DRRBS | cfDNA-RBS | Micro-RBS | sc-RBS |
|---|---|---|---|---|---|
| 原理 | MspI酶切+连接接头 | 多酶切+连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 | CCGG邻近片段连接接头 |
| 样本要求 | 1μg | 1μg | 1ng | 1ng | 单细胞/1-10个细胞 |
| 测序数据量 | 10G | 15G | 20G | 20G | 2G |
| 5XCG位点覆盖 | 6M | 8M | 6M | 10M | 4-8M |
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案。
参考文献：
Deng Q, Du Y, Wang Z, Chen Y, Wang J, Liang H, Zhang D. Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma. BMC Genomics. 2023 Jun 7;24(1):307.
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