Microbe-seq: high-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome
doi: https://doi.org/10.1101/2020.12.14.422699
孙苗 报告撰写（介绍部分）学号：22020080035
吕焱 报告撰写（主体部分）学号：22020080028
方妍 报告撰写（总结部分）学号：22020080092
方子轩 报告撰写（总结部分）学号：22020080094
微生物群落栖息在许多自然生态系统中，包括海洋、土壤和动物的消化道。其中一个复杂而重要的群落就是人类肠道微生物群。胃肠道中有数万亿的微生物，这些微生物群与人类健康和疾病有重大关联，包括代谢综合征、认知障碍和自身免疫性疾病等。微生物群落的行为和生物效应不仅与其组成有关，同时也受到每个微生物内部生化过程，以及它们之间的相互作用，以及群落中个体微生物的基因组的强烈影响。
肠道微生物群的个体组成是特定的，虽然人们在许多情况下携带相似的微生物物种，但不同的个体有不同的亚种菌株，这些亚种菌株表现出显著的基因组差异，包括点突变和结构变异。这些菌株之间的基因组变异可能导致重要性状的差异，包括抗生素耐药性和代谢能力，这可能会对人类健康产生重大影响。来自同一微生物组的同一亚种菌株的单个微生物在很大程度上共享相同的基因组。因此，能将高质量的基因组分析到群落内广泛的微生物类群的亚种菌株水平，将为理解微生物基因组提供根本性的改进。
现在已经有几种方法被用来探索人类肠道微生物组的基因组学，如宏基因组学，在该技术中，大量的微生物被裂解并进行DNA测序，从而获得微生物群落基因组内容的广泛调查。然而，宏基因组学通常无法分配单一样本中多个分类单元共有的DNA序列。因此，宏基因组学一般不能用亚种株解析来解析基因组，从而限制了我们对个体人类肠道微生物组基因组结构和动力学的知识。因此需要一种实用的、具有成本效益的方法来获得单微生物基因组信息。
本文介绍了一种高通量获取大量个体微生物基因组的方法——微生物测序(Microbe-seq)。使用微流体装置将单个微生物封装成液滴，然后裂解、放大全基因组，并在这些液滴中对DNA进行条形码。实现了更高的吞吐量比实际可与滴定板。研究了人类肠道微生物群，分析了从一名健康受试者采集的7份纵向粪便样本，获得了21,914个单扩增基因组。与来自相同样本的宏基因组进行比较，发现这些单扩增基因组捕获了相似水平的多样性，即可以利用Microbe-seq，探测群落内微生物相互作用的基因组特征。
主要通过用裂解试剂包封到液滴中来分离微生物。每种微生物被裂解以释放DNA。裂解后，将扩增试剂添加到每个液滴中以扩增每个单独液滴中的单个微生物基因组。将标签片段化试剂添加到每个液滴中以片段化扩增的DNA并用衔接子标记它们。将聚合酶链式反应（PCR）试剂和具有DNA条形码的珠粒添加到每个液滴中。进行PCR以用这些引物标记基因组材料，这些引物含有两个部分，一个是每个液滴特有的条形码序列，另一个是与先前加入的衔接子退火的序列。将液滴破碎以将条形码化的单微生物DNA合并在一起，然后，我们打破液滴，添加测序衔接子，并测序。
为了探索这种单微生物测序的实用性，我们将基于液滴的方法应用于一个复杂的微生物群落。我们探索了人类肠道微生物群，预计将包含大约100种，检查了从一名健康个体收集的一年半多来的7份粪便样本。
人肠道微生物组包含大量微生物分类群，其多样性通常用宏基因组学评估。为了评估通过基于液滴的方案测量的多样性，与宏基因组方法相比，收集了来自每个样品中所有单扩增基因组的所有读段，并忽略连接来自相同单扩增基因组的读段的条形码信息，这产生了与宏基因组学中使用的结构相似的数据集。文章通过与微生物基因组的公共数据库进行比较，在属水平上对每个样品中的每个读段进行分类，还对来自相应宏基因组数据集的每个读段进行这种属水平的比较。文章使用基于液滴的方法和使用宏基因组学来确定每个属的相对丰度，为了比较这些结果，将两个丰度值绘制在具有相等轴的散点图上，两种技术报告了相似的值，这些数据表明，Microbe-seq鉴定了与宏基因组学相似范围的分类群的存在。此外，还观察到使用基于液滴的方法获得的数据中存在病毒，这与宏基因组学中的相同观察结果一致。这些数据表明，基于液滴的方法捕获与使用宏基因组学捕获的多样性相同。
文章又通过对该方法的完善，使该方法能够从具有100多个单扩增基因组的物种中解析亚种菌株并重建其菌株解析的基因组，即使这些单扩增基因组仅覆盖了大约10%的基因组。此外，这种基于液滴的方法可以从未培养的菌株中获得菌株解析的基因组，这对人类肠道菌群具有特别重要的意义，因为肠道菌群中的许多菌株都很难培养。因此，该方法提供了一种新的方法来检测菌株解析的结构和人类肠道微生物群中基因组信息的动态。这些高质量的、菌株解析的基因组来自于一个人的肠道微生物群的广泛菌株，不仅可以更精确地识别绝大多数的单扩增基因组，而且还可以进一步探索微生物群落的更广泛的基因组方面，特别是那些涉及不同菌株的微生物。
微生物群落基因组令人兴奋的方面是微生物如何交换遗传信息。最著名的机制之一是水平基因转移（HGT），已观察到其在人类肠道微生物组中是常见的。源自单个人的肠道微生物组的大量菌株解析基因组提供了全面且准确地检测特定微生物分类群之间共享的序列的潜力。在两种不同微生物物种之间建立HGT的一种方法鉴定了在两者的基因组中存在的共同序列，并且通常利用培养的分离株，来自每个培养的分离株的读数最终来自单个微生物。因此这些读段通常与单个菌株的基因组相连。相比之下，宏基因组读取来自多个不同的物种和菌株，短读取通常不能与之连接，因此仅用宏基因组学测定HGT极具挑战性。在目前的工作中，将每个读取连接到单个SAG的能力提供了一种克服这一挑战的可能的方法，通过识别不同物种的菌株解析基因组的共同序列，而不确定它们发生的菌株的不确定性。
为了评估这种方法在单个人身上检测HGT的有效性，我们鉴定了13个高质量菌株分辨共组装基因组之间的共同序列，其中我们也有相应的分离基因组。我们在这13个菌株解析的共组装基因组中鉴定出19对HGT；对13个相应的培养分离物基因组应用相同的分析，我们也确定了这些相同的对，加上另外一对，这些数据对应于95%的符合率，没有假阳性，证明了该方法的敏感性和特异性。这些观察表明了解人类肠道微生物组内HGT性质的大量菌株分辨、高质量基因组的重要性。
该方法不仅限于细菌，还适用于其他类型的微生物，如多样性分析揭示了病毒的存在，特别是crAsphage，这是目前从人肠道微生物组中识别的最丰富的噬菌体。噬菌体的一般调节作用，被认为只是在复杂的微生物群落中才开始显现调节细菌的丰度和行为。基于液滴的方法不仅包封单个细菌，而且包封与其物理共定位的任何噬菌体，从而提供探测宿主-噬菌体缔合的直接手段。为了探索这种关联，将每个SAG中的读段与crAssphage基因组进行比较，发现几十个SAG含有相当大部分的crAssphage对齐的读段。此外，这些SAG中的许多还含有显著部分的读段，其不与crAssphage基因组比对，而是与细菌分类群比对，我们将这些读段与76个物种的共组装基因组进行比对，以鉴定哪些细菌物种可能与该特定个体中的crAsphage菌株相关。结果发现14个SAG仅与一个物种普通拟杆菌相关，并且没有其他物种与crAsphage显著相关。这些数据强烈地表明普通拟杆菌是该个体中crAssphage的体内宿主物种，这与crAssphage可能与拟杆菌属物种相关的先前证据一致。这些数据证明了基于液滴的方法的独特优势，以准确地建立体内宿主-噬菌体缔合，不仅与单个物种，而且甚至更精确地与特定菌株。我们鉴定哪些细菌菌株与噬菌体相互作用，哪些菌株不相互作用;这些菌株之间的基因组差异提供了可能有助于理解这些宿主-噬菌体相互作用的分子机制及其在人肠道微生物组中的纵向动力学的初步数据。
综上，微生物测序提供了一种特别有效和实用的方法，可以在没有任何微生物组成的先验知识的情况下，完全识别和测序人类肠道微生物组以外的微生物群落中的所有主要菌株。该方案集成了之前应用于其他场合的经过验证的液滴微流体操作，与使用单细胞测序方法相比，在产量和成本方面提高了约100倍。这种实际的改进可能使研究微生物群落成为可能。