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植物通过改变数千个基因的mRNA丰度以促进其生理和代谢过程，从而对低温应激进行响应。在转录后水平上，这些冷应激应答转录本经历可变剪接、microRNA介导的调控和可变多腺苷酸化等。最近研究表明，m6A、m5C等RNA修饰可以影响RNA调控和鉴定mRNA修饰稳定性，从而揭示了另一层在调控基因表达中发挥重要作用的转录后调控。m6A在植物生长发育中的重要性已经得到了重视，但m6A在胁迫条件下的重要性仍未得到充分探讨，因此m6A修饰在冷胁迫条件下的应激机制研究具有非常重要意义。
2022年8月，美国俄克拉荷马州立大学Ramanjulu Sunkar团队和宾夕法尼亚大学Brian D. Gregory团队合作以“mRNA N6-methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis”为题在《the plant journal》杂志发表研究论文，该研究以拟南芥为对象，通过甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）揭示了表观转录组（m6A甲基化）在拟南芥抗寒性中的关键作用。
标题：mRNA N6-methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis（mRNA N6-甲基腺苷对拟南芥的抗寒性至关重要）
时间：2022-08
期刊：the plant journal
影响因子：IF 7.2
技术平台：m6A-seq（MeRIP-seq）、polysomal-seq（翻译组）、qRT-PCR、Dot-blot等
研究摘要：
本研究为了检测m6A修饰在冷胁迫应激响应中的作用，对冷胁迫（chilling stress）（4°C）24小时的拟南芥幼苗中进行了甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq），在转录组范围进行m6A甲基化分析，分析揭示了m6A修饰在低温胁迫下的大范围变化。由于已知m6A会影响转录本的稳定性/降解和翻译，本研究分析了这些可能性，分析结果表明在冷胁迫下，冷富集m6A转录本在冷胁迫下表现出mRNA丰度的最大增加，同时核糖体（ribosome）率增加。利用m6A甲基转移酶主要基因突变的mta突变体进一步评估m6A表观转录组对植物抗寒性的意义。与野生型相比，随着CBF和COR基因表达水平的差异，mta突变体对冷处理表现出超敏反应，这由根的初生生长、生物量和活性氧积累决定。此外，非驯化和冷驯化的mta突变体都表现出对抗冷冻的超敏反应。总之，本研究表明了表观转录组在拟南芥抗寒性中的关键作用。
研究结果
（1）MeRIP-seq鉴定在冷胁迫下m6A富集或m6A缺失的转录本
图1：拟南芥m6A表现出3′UTR位点偏倚，对冷胁迫无响应的peaks偏倚更强。
（a） 冷处理样品和对照处理样品的生物学重复进行重叠获得的高置信度m6A peaks分析鉴定出5829个对照富集（冷缺失）peaks、1318个冷富集m6A peaks和11个 943个共有peaks（未改变）。
（b） MeRIP-seq reads沿分类转录本的分布。
（c） 通过homer鉴定的RNA motif在目标m6A peaks区域中富集。
（d） 与5′UTR、起始密码子、CDS、终止密码子和3′UTR重叠的冷富集、对照富集和共有m6A peaks的百分比分布。
（e） 转录本的冷富集、对照富集和共有m6A peaks起始和终止密码子周围区域甲基化的核苷酸水平。每个组都被标准化为其在该区域中的最大值
（2）冷应激诱导大范围转录组变化
图2：低温胁迫24小时后的转录组学分析结果表明，已知的主要冷响应基因的mRNA丰度增加。
（a）与对照Col-0植株相比，低温处理植株的整体冷诱导的转录组变化MA图。红点代表RNA丰度变化有统计学意义的转录本（调整P<0.05），灰色表示没有变化的转录本。蓝点突出显示已知与植物冷胁迫响应相关的转录本。
（b）在冷胁迫期间显著增加或减少的转录本相关的GO分析热图
（c） 冷处理和对照条件下mRNA丰度的倍数变化与转录本的冷处理和对照组中富集m6A peaks的差异及共有分析
（3）冷富集m6A peaks的转录本表现出多聚体结合增加
图3：冷富集m6A转录本的peaks对冷处理表现出更高的mRNA丰度和核糖体占有率。
（a） 对照处理和冷处理之间转录本的核糖体占有差异，比较只冷处理和只对照中转录组富集m6A peaks之间的差异，以及在两种条件下的共有差异。
（b）对冷富集m6A转录本的peaks GO分析的生物功能分类。
（c） 基因组浏览器视图（Genome browser views）分析比较主要已知冷调控转录本的meRIP-seq（标记为m6A）、mRNA-seq（标为mRNA）和多聚体分析（polysome profiling，标记为Ps-seq）。箭头表示基因转录的方向。
（4）mta突变体植株对冷胁迫表现出超敏反应
图4：与Col-0植株相比，mta突变体的冷响应揭示了mRNA丰度和多聚体负载差异。
（a）qPCR方法检测与Col-0植物相比，对照和冷条件下MTA突变体中MTA转录本的相对mRNA水平。
（b）与Col-0植株相比，mta突变体的表型检测和冷响应定量分析，
（c）根长（对照幼苗在22°c下生长10 天，而在冷处理下幼苗生长了52天）
（d）鲜重。
（e） 长期低温胁迫后叶片组织中ROS的积累情况。
图5：通过电解质渗漏测定法（electrolyte leakage assay）分析mta突变体对冷冻胁迫响应的敏感性。
对5周龄的未驯化（NA）（a）和冷驯化（CA，4°C，7 天）（b）的Col-0和mta突变体植株进行电解质渗漏检测分析。✳表示有统计学意义的差异（P<0.05，t检验）。
（5）冷胁迫下mta突变体的CBF和COR基因表达水平
图6：qPCR分析表明，冷富集m6A转录本与RNA丰度以及核糖体占有率之间存在潜在相关性。在Col-0和mta中，候选CBF和COR基因的相对mRNA丰度和多聚体负载的变化通过对照和低温条件下的倍数变化来分析。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案，详询易基因0755-28317900。
参考文献：
Govindan G, Sharma B, Li YF, Armstrong CD, Merum P, Rohila JS, Gregory BD, Sunkar R. mRNA N6 -methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis. Plant J. 2022 Aug;111(4):1052-1068.
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