蔡司激光共聚焦荧光显微镜 (六)-526互联

13、高级功能：Z-Stack、Tiles、Time Series（该篇目之前的流程每次都要做）

（1）Z-Stack

Z-Stack 即 3D 成像，有两种模式。主要使用“First / Last”模式，通过上下边界决定 3D 成像的 Z 轴范围；另一种是“Center”模式，主要通过设定 Z 轴的中间位置和 3D 厚度来决定成像范围。

· √ 上“Z-Stack”，再挑选一个感兴趣的通道，点击“Live”预览。一边预览一边确定轴的拍摄界面，即拍摄此较厚的样品可将上下界面的图像进行叠加。

· 左边第二列打开“Z-Stack”框。

· 设置拍摄范围，需要一边调焦一边确定上下边界。

· 首先按住 Ctrl 调鼠标滚轮，调到一个边界，点击“Z-Stack”的“Set First”按钮，即从这开始拍。按下来反方向调焦调到另一个边界，点击“Set Last”，即到这结束。

· 软件会自动算出范围厚度在“Range”，“Optimal”即 _μm 拍一层效果会比较好，点一下这个值会直接复制到“Interval”即设置 _μm 拍一层。如不那么 care 分辨率可调该选项，拍摄速度会随拍摄层数减少而加快。

· 第一列“Start Experiment”左边有个选项：“All Tracks per Slice”即每个 slice 拍所有通道，对于固定样品不建议；“Full Z-Stack per Track”即每个 Track 拍完所有层再换另一个通道上下拍完所有层再换另一个通道上下拍完所有层，建议此选项。

· 点击“Start Experiment”。

· 拍完之后，图像下面有个 Z-Stack 轴，拖动它会出现不同层面的信号。

如果是使用 Best signal 建立多个 track，在 Z-Stack 成像时，在光路中选择“Switch track every ‘Z-Stack’”能够显著提高成像速度，但是这个方法不适合快速变化的样品。

Z-Stack 之后通常有两种处理：直接叠加所有层面和处理成 3D 图像。

①叠加所有层面

点击“Split”就是分屏去看每一个信号通道的图像；“Gallery”就是拍的每一个层面图像；

“Ortho”图像上方的横轴指的是 X-Z 图像，右方的纵轴指的是 Y-Z 轴。如果想要做最大强度投影，√ 上“Maximum Intensity Projection (MIP)”，这是把每一层的信号都叠加到一张图去了。

这时候如果想把中间的图像拽出来，点击下面的“New Image from”的“Current View”，一般可以选择 X-Y Plane，然后点击“Create”生成。于是生成了一个具备叠加效果的二维图像。

生成叠加效果的二维图像

②3D 图像

图像左侧那一栏选择“3D”，于是呈现出 3D 效果，可以随意拖拽。

如果想要拍下该 3D 图像某个角度的画面，点击下方“Create Image”。

如果想要生成视频，在软件里面也可以实现。点击图像下方的“Series”可视化，在“Render Series”处可选择“Turn around X”沿 X 轴转，一般勾选“360° Panorama”让它 360° 旋转。右边“Frames”选择旋转 30 幅。设置完成后点击“Apply”，会生成一个文件，最下面那一栏会有一个进度条。