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DNA甲基化是表观遗传学中最重要的修饰之一，在免疫应答中发挥着重要作用。自引进大菱鲆（Scophthalmus maximus，商品名：多宝鱼）以来，养殖规模不断扩大，其间各种细菌、病毒和寄生虫引起的疾病日益严重。因此，灭活疫苗以其独特优势在水产品领域得到广泛的研究和应用。然而，大菱鲆接种杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）灭活疫苗后的免疫机制尚不清楚。
2023年2月7日，青岛农业大学海洋科学与工程学院副教授修云吉博士团队在《Frontiers in Immunology》杂志发表题为“Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation”的研究论文，该研究通过WGBS和对应的RNA-seq分析，从DNA甲基化的角度揭示了杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）灭活疫苗免疫大菱鲆后的免疫机制。
标题：Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation（从DNA甲基化角度分析杀鲑气单胞菌灭活疫苗对大菱鲆的免疫作用）
时间：2023-02-07
期刊：Frontiers in Immunology
影响因子：7.3 / 1区
技术平台：WGBS、RNA-seq、双荧光素酶报告基因实验等
研究摘要：
本研究采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）筛选差异甲基化区域（DMRs），采用转录组测序（RNA-seq）筛选显著差异表达基因（DEGs）。双荧光素酶报告实验和DNA pull-down实验进一步验证了用杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）灭活疫苗免疫后基因启动子区的DNA甲基化水平对基因转录活性的作用。
研究结果共筛选出8149个差异甲基化区域(differentially methylated regions, DMRs)，其中包括许多DNA甲基化水平变化的免疫相关基因。同时鉴定出386个显著差异表达基因(DEGs)，其中许多基因在Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和C型凝集素受体信号通路中显著富集。结合WGBS结果和RNA-seq结果分析，共有9个负调控基因的DMRs位于启动子区，包括2个低表达的高甲基化基因和7个高表达的低甲基化基因。随后筛选出两个免疫相关基因：C5a过敏毒素趋化受体1样(C5ar1-Like)基因和嗜酸粒细胞过氧化物酶样(EPX-Like)基因，以探讨DNA甲基化修饰对其表达水平的调控机制。此外，基因启动子区的DNA甲基化水平通过抑制转录因子结合以影响基因转录活性，从而导致基因表达水平变化。
综上，本研究通过共同分析WGBS和RNA-seq结果，从DNA甲基化角度揭示了大菱鲆用杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）灭活疫苗免疫后发生的免疫机制。
材料方法：
研究结果：
（1）转录组测序结果分析
表2：样本数据质量
表3：样本和参考基因组的比对
图1：转录组测序筛选差异基因。
（A） Venn图显示了AsVSm和NVSm基因的差异。
（B） 条形图显示了显著DEG数量的统计数据。
（C） 显著DEG的聚类热图。横坐标表示样品名称，纵坐标表示均质化后fpkm的值。红色表示高表达，绿色表示低表达。
（D） 显著DEG的GO富集分析。
（E） KEGG富集散点图。AsVSm与NVSm中最显著富集DEG的前20条通路。
（2）全基因组重亚硫酸盐测序分析
表4：WGBS的output数据质量
表5：WGBS中reads与参考基因组的比率
表6：全基因组甲基化水平
表7：mC的数量和百分比分布
图2：通过全基因组亚硫酸盐测序筛选DMR和相关基因。
（A）基因区域上游和下游2K区域样本甲基化水平分布。
（B）mCG序列环境中基因功能区甲基化水平的热像图分析结果。
（C）DMGs在不同序列环境（CG，CHG，CHH）中锚定启动子区域的共有和独有基因集数量。
（D）不同序列环境（CG，CHG，CHH）中DMR甲基化水平的聚类热图。
（E）在CG序列环境中DMG的GO富集分析。
（F）在CG序列环境中DMGs显著富集的前20个通路。
（3）WGBS与RNA-seq的关联分析
图3：甲基化修饰对基因表达水平的调控
- CG序列环境中基因表达水平和甲基化水平的分布。
- DMG和DEGs之间重叠基因的统计。
- 启动子区CG序列环境中重叠基因的GO富集分析。
- 显著富集甲基化负调控基因的通路统计。
（4）DNA甲基化负调控基因表达
图4：DNA甲基化负调控基因表达
- AsVSm组和NVSm组中C5ar1-Like基因的相对表达水平。
- AsVSm组和NVSm组C5ar1-Like基因启动子区平均甲基化水平。
- AsVSm组和NVSm组EPX-Like基因的相对表达量。
- AsVSm组和NVSm组EPX-Like基因启动子区平均甲基化水平。* p < 0.05。
（5）DNA甲基化抑制免疫相关基因表达的机制
图5：DNA甲基化抑制免疫相关基因表达的机制
- 来自C5ar1-Like和EPX-Like启动子区的扩增片段。不同颜色代表不同的基因片段。
- DNA甲基化修饰对C5ar1-Like启动子区荧光活性的影响。
- DNA甲基化修饰对EPX-Like启动子区荧光活性的影响。*代表性显著性差异(P<0.05)。
- HEK293T核蛋白的考马斯蓝染色(coomassie blue staining)。
- DNA pull down富集蛋白的银染色（Silver staining）。红框显示met-SmC5ar1-Like和SmC5ar1-Like的不同条带。
- MS鉴定的met-SmC5ar1-Like和SmC5ar1-Like互作蛋白的总数。
研究小结：
本研究通过WGBS和RNA-seq等分析表明，在接种杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）灭活疫苗后，大菱鲆肾组织中许多DNA甲基化水平和基因表达发生变化。此外，双荧光素酶报告实验和DNA pull down结果验证了基因启动子区DNA甲基化修饰可通过抑制转录因子与基因启动子区结合而影响基因表达。本研究结果揭示了灭活疫苗对大菱鲆肾组织DNA甲基化水平和基因表达的影响，探索了DNA甲基化在大菱鲆抗性育种中的潜在应用，为大菱鲆遗传改良提供了新思路。
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势：
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，详询易基因：0755-28317900。
参考文献：
Li Y, Su L, Liu X, Guo H, Zhou S, Xiu Y. Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation. Front Immunol. 2023;14:1124322.
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